Ekspresjon, rensing og antimikrobiell aktivitet av S100A12

Summary

Her presenterer vi en metode for å uttrykke og rense S100A12 (calgranulin C). Vi beskriver en protokoll for å måle sin antimikrobielle aktivitet mot det humane patogenet H. pylori .

Abstract

Calgranulin-proteiner er viktige mediatorer av medfødt immunitet og er medlemmer av S100-klassen i EF-hånd-familien av kalsiumbindende proteiner. Noen S100 proteiner har kapasitet til å binde overgangsmetaller med høy affinitet og effektivt sekvestrere dem fra invaderende mikrobielle patogener i en prosess som kalles "ernæringsmessig immunitet". S100A12 (EN-RAGE) binder både sink og kobber og er svært rikelig i medfødte immunkeller som makrofager og nøytrofiler. Vi rapporterer en raffinert metode for uttrykk, anrikning og rensing av S100A12 i sin aktive, metallbindende konfigurasjon. Utnyttelse av dette proteinet i bakteriell vekst og levedyktighetsanalyser viser at S100A12 har antimikrobiell aktivitet mot bakteriepatogenet Helicobacter pylori . Den antimikrobielle aktiviteten er basert på den sinkbindende aktiviteten til S100A12, som chelaterer næringssink, derved sultende H. pylori som krever sink for vekst og proliferation.

Introduction

S100 proteiner er en klasse av EF-hånd-familien av kalsiumbindende proteiner med et mangfoldig utvalg av funksjoner ¹ . De uttrykkes i vev og celle-spesifikk måte, og regulerer et bredt spekter av cellefunksjoner ^{2 , 3} . Unik for kalsiumbindende proteiner, S100-proteiner viser både intracellulære og ekstracellulære funksjoner ^{4 , 5} . Innenfor cellen fremkaller Ca ²⁺ -binding en konformasjonsendring som avslører en hydrofob overflate som spesifikt retter seg mot proteinbindingspartnere ⁶ . Denne intracellulære mekanismen regulerer viktige prosesser som celleproliferasjon, differensiering og energi metabolisme. I det ekstracellulære miljøet utviser S100-proteiner to funksjoner ⁷ . I en, fungerer de som skade-relaterte molekylære mønster (DAMP) proteiner og initierer en pro-inflammatorAtorisk immunrespons gjennom interaksjon med mønstergenkjenningsreceptorer ^{8 , 9} . I tillegg har flere medlemmer av S100 proteinklasse-sekvestreren overgangsmetaller, en funksjon som tjener til å sulte mikrobielle patogener i en prosess betegnet næringsimmunitet ^{10 , 11} .

S100A12 (også kjent som calgranulin C og EN-RAGE) er svært uttrykt i makrofager og nøytrofiler og har blitt identifisert som en potensiell biomarkør for inflammatoriske sykdommer ^{12 , 13} . I tillegg til bindende kalsium ved sine EF-Hand-steder, har S100A12 to høyaffinitetsovergangsmetallbindingssteder lokalisert i motsatte ender av dimergrensesnittet ^{14 , 15} . Hvert bindingssted består av tre histidinrester og en asparaginsyrerest og kan chelere sink eller kobber <Sup class = "xref"> 16 ^{, 17} . Nylig rapporterte vi at S100A12-avhengig sinkhung er viktig for å regulere Helicobacter pylori- vekst og aktiviteten av proinflammatoriske virulensfaktorer ¹⁸ .

H. pylori infiserer magen på omtrent halvparten av verdens menneskelige befolkning; Noe som gjør det uten tvil en av de mest vellykkede bakterielle patogener ¹⁹ . Infeksjon med H. pylori kan føre til signifikante gastriske sykdomsutfall, inkludert gastritt, peptisk og duodenalt sår, slimhinde assosiert lymfoidvev (MALT) lymfom og invasivt gastrisk adenokarsinom (magekreft). Magekreft er den viktigste årsaken til ikke-kardiokreft-assosiert død i verden, og den største enkeltstående risikofaktoren for magekreft er infeksjon med H. pylori .

H. pylori fortsetter i gastrisk nisje til tross for en robuSt immunrespons på patogenet, understreker behovet for en bedre forståelse av immunmekanismer for å kontrollere denne bakterielle infeksjonen ^{20 , 21 , 22 , 23} . H. pylori- assosiert betennelse er preget av en dyp infiltrering av polymorfonukleære celler eller nøytrofiler som deponerer et repertoar av antimikrobielle proteiner, inkludert S100A12, på infeksjonsstedet ^{18 , 24 , 25} . I et forsøk på å forstå den komplekse dialogen mellom verten og patogenet, søkte vi å avgrense teknikken for å rense S100A12 og bruke den til å studere den antimikrobielle påvirkning den utøver på dette medisinsk relevante patogenet. Protokollen nedenfor skisserer en forbedret teknikk for S100A12 rensing i sin biologisk aktive tilstand; I stand til å binde næringsmetaller med høy affiniTy og chelater dem bort fra invaderende mikroorganismer. Videre fremhever metodene nedenfor bruken av dette proteinet som et kritisk reagens for å studere mekanismen ved hvilke medfødte antimikrobielle molekyler begrenser veksten av bakterielle patogener.

S100A-familieproteiner har fått takknemlighet som en viktig gruppe medfødte immunsystemmolekyler som deltar i immunsignaler samt vert-forsvar ²⁷ . De mest godt studerte av disse er calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) ^{28 , 29 , 30} . Calprotectin er et neutrofilt assosiert protein som danner en heterodimer av S100A8- og S100A9-underenhetene som binder overgangsmetaller ved dimergrensesnittet ³¹ . Calprotectin har vist seg å ha to metallbindingssteder: Nettsted 1 kan binde Zn ²⁺ , Mn ²⁺ , eller Fe ²⁺ og Site 2 kan Bind Zn ^{2+ 31 , 32} . Tallrike rapporter har vist at calprotectin har antimikrobielle aktiviteter mot forskjellige patogener, inkludert Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli og H. pylori , og at de hemmeffektene skyldes metallkeleringsaktiviteten til calprotectin ^{25 , 28 , 29} .

Tidligere arbeid demonstrert calprotectin utøver en rekke aktiviteter på H. pylori, inkludert å endre lipid A-strukturen i den ytre membranen, undertrykke cag- Type IV sekresjonssystemet (som er en stor proinflammatorisk virulensfaktor innen H. pylori ), indusere biofilmdannelse og undertrykke H. pylori vekst og levedyktighet på en doseavhengig måteClass = "xref"> 25 ^{, 33} . Videre viste genetiske og biokjemiske analyser den antibakterielle aktiviteten til calprotectin mot H. pylori i stor grad avledet fra sin evne til å binde næringssink ²⁵ . H. pylori krever sink, som ble bestemt av tidligere forskning som benyttet et kjemisk definert medium for å fastslå mikronæringsstoffkravene for dette patogenet for å vokse og proliferere ³⁴ . I tillegg var calprotectin svært rikelig innenfor H. pylori- infiserte vev og assosiert med neutrofile infiltrater, hvilket indikerer at verten kan benytte calprotectin som en antimikrobiell strategi under infeksjon og påfølgende inflammasjon ^{25 , 35} .

Nylige bevis fra objektive proteomics screening teknikker antyder at under forhold der reaktive oksygen arter er rikelig, calprotecTinn gjennomgår posttranslasjonelle modifikasjoner som endrer heksa-histidinbindingsstedet og derved hemmer den metallbindende aktivitet av proteinet ³⁶ . Som sådan antydet vi at andre S100A-familieproteiner blant det brede repertoaret av disse molekylene kunne potensielt fungere som hjelpemetallkelatorer. Vi valgte S100A12 for videre studier fordi den ikke ble identifisert i den nevnte skjermen for posttranslasjonell modifikasjon, den har kapasitet til å binde sink, og den er svært rikelig i humant vev avledet fra H. pylori- infiserte personer.

Vårt arbeid indikerer at S100A12 kan hemme H. pylori vekst og levedyktighet på en doseavhengig måte i G27-stammen av H. pylori , og at den antimikrobielle aktiviteten til dette proteinet kan reverseres ved tilsetning av overskudd av næringsinnholdssink. Dette arbeidet kompletterer vårt tidligere arbeid som indikerer at S100A12 utøver antimikrobiell aktivitet mot PMSS1 og 7.13 stammer av H. pylori , som demonstrerer sin brede antibakterielle aktivitet mot mange kliniske isolater og laboratorie-tilpassede stammer av H. pylori ¹⁸ . Sammen, disse resultatene bekrefter betydningen av S100A12 som en mekanisme for å kontrollere bakteriell vekst og spredning via ernæringsmessig immunitet. Fremtidige studier av denne viktige vertsbakterieinteraksjonen kan omfatte å utnytte aktiviteten til S100A12 for å redusere bakteriell byrde i vertsvev, eller bestemme bidraget av dette proteinet til immun-signalering i sammenheng med H. pylori- infeksjon.

Protocol

1. Ekspression av S100A12 Transform kompetent BL21 DE3-celler med et pGEMEX-S100a12-plasmid ved bruk av en standard varmeskokprotokoll 18 . Tilsett 1 til 5 μl plasmid til 50 μl bakterier i et mikrocentrifugerør på is. Inkuber i 20 min. Varm støt cellene ved 42 ° C i 30 s. Inkubér cellene på is i 2 minutter. Tilsett 500 μL SOC media til cellene. Inkuber ved 37 ° C ved risting ved 250 rpm på en orbital shaker i 1 time. Plate 150 μl av t…

Representative Results

S100A12-uttrykk og rensing En tre-trinns rensing ga ~ 40 mg rekombinant S100A12 fra 50 ml bakteriekultur. Det første trinnet var en ammoniumsulfatutfelling av endogene E. coli- proteiner. Dette trinn ble fulgt av anionbytterkromatografi ( figur 1A ). Proteinet spores av en SDS-PAGE farget med Coomassie Brilliant Blue ( figur 1B ). Det siste trinnet i rensingsprosedyren …

Discussion

En effektiv protokoll for både ekspresjon og rensing av human S100A12 presenteres. E. coli- ekspresjonssystemet er det vanligste verktøyet som brukes til fremstilling av rekombinante proteiner, spesielt når mg mengder kreves for biokjemiske og biofysiske studier. En nøkkelforbedring av prosedyren beskrevet her er bruk av auto-induksjonsmedium ²⁶ som øker utbyttet av renset protein med en faktor på nesten tretti sammenlignet med ekspresjon med standard Luria-buljongmedium <sup class…

Materials

S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells	New England Biolabs	C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract	Research Products International	Y20020-250.0
NaCl	Research Products International	S23020-500.0
Tryptone	Research Products International	T60060-250.0
FeCl3	Sigma-Aldrich	F2877
MgSO4	Research Products International	M65240-100.0
Na2HPO4	Research Products International	S23100-500.0
KH2PO4	Research Products International	P41200-500.0
NH4Cl	Research Products International	A20424-500.0
Na2SO4	Research Products International	S25150-500.0
Glycerol	Research Products International	G22020-1.0
D-glucose	Research Products International	G32040-500.0
lactose	Sigma-Aldrich	L2643
Selection agent
ampicillin	Research Products International	A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System	GE	29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow	GE	17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR	GE	17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE
Tris Base	Research Products International	T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates	Lab Supply Company	BBL221261
Brucella broth	Sigma-Aldrich	B3051
Cholesterol (250X)	Thermo Fisher Scientific	12531018
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	229997