Expression, rening och antimikrobiell aktivitet av S100A12
Summary
Här presenterar vi en metod för att uttrycka och rena S100A12 (kalgranulin C). Vi beskriver ett protokoll för att mäta dess antimikrobiella aktivitet mot den mänskliga patogenen H. pylori .
Abstract
Calgranulin-proteiner är viktiga medlare av medfödd immunitet och är medlemmar i S100-klassen i EF-hand-familjen av kalciumbindande proteiner. Vissa S100 proteiner har kapacitet att binda övergångsmetaller med hög affinitet och effektivt sekvestrera dem bort från invaderande mikrobiella patogener i en process som kallas "näringsrik immunitet". S100A12 (EN-RAGE) binder både zink och koppar och är mycket rikligt i medfödda immunceller, såsom makrofager och neutrofiler. Vi rapporterar en förfinad metod för uttryck, berikning och rening av S100A12 i sin aktiva, metallbindande konfiguration. Utnyttjande av detta protein i bakteriell tillväxt och genomförbarhetsanalyser visar att S100A12 har antimikrobiell aktivitet mot bakteriepatogenen Helicobacter pylori . Den antimikrobiella aktiviteten är baserad på den zinkbindande aktiviteten hos S100A12, som chelaterar näringszink och därmed svälter H. pylori som kräver zink för tillväxt och proliferation.
Introduction
S100-proteiner är en klass av EF-hand-familjen av kalciumbindande proteiner med en mängd olika funktioner 1 . De uttrycks på ett vävnads- och cellspecifikt sätt och reglerar ett brett spektrum av cellulära funktioner 2 , 3 . Unika för kalciumbindande proteiner, S100-proteiner uppvisar både intracellulära och extracellulära funktioner 4 , 5 . Inuti cellen inducerar Ca2 + -bindning en konformationsändring som exponerar en hydrofob yta som specifikt riktar proteinbindande partner 6 . Denna intracellulära mekanism reglerar viktiga processer som cellproliferation, differentiering och energimetabolism. I den extracellulära miljön uppvisar S100-proteiner två funktioner 7 . I en fungerar de som skador associerade molekylära mönster (DAMP) proteiner och initierar en pro-inflammatorAtom immunsvar genom interaktion med mönsterigenkänningsreceptorer 8 , 9 . Dessutom adderar flera medlemmar av S100 proteinklass-sekvestreringsmetaller, en funktion som tjänar till att svälta mikrobiella patogener i en process som kallas näringsmässig immunitet 10 , 11 .
S100A12 (även känd som calgranulin C och EN-RAGE) uttrycks starkt i makrofager och neutrofiler och har identifierats som en potentiell biomarkör för inflammatoriska sjukdomar 12 , 13 . Förutom bindande kalcium vid sina EF-Hand-ställen har S100A12 två högaffinitetsövergångsmetallbindningsställen belägna i motsatta ändar av dimergränssnittet 14 , 15 . Varje bindningsställe består av tre histidinrester och en asparaginsyrarest och kan kelatera zink eller koppar <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Nyligen rapporterade vi att S100A12-beroende zinksulten är viktig för att reglera Helicobacter pylori -tillväxten och aktiviteten av proinflammatoriska virulensfaktorer 18 .
H. pylori infekterar magen på ungefär hälften av världens mänskliga befolkning; Gör det förmodligen ett av de mest framgångsrika bakteriepatogenerna 19 . Infektion med H. pylori kan leda till signifikanta gastriska sjukdomar, inklusive gastrit, peptiskt och duodenalt sår, slemhinnor associerad lymfoid vävnad (MALT) lymfom och invasivt gastrisk adenokarcinom (magkreft). Magskräft är den främsta orsaken till den icke-kardiocancerrelaterade döden i världen, och den enskilt största associerade riskfaktorn för magcancer är infektion med H. pylori .
H. pylori kvarstår i magisk nisch trots en robuSt immunsvar mot patogenen, vilket understryker behovet av en bättre förståelse av immunmekanismer för att kontrollera denna bakteriella infektion 20 , 21 , 22 , 23 . H. pyloriassocierad inflammation kännetecknas av en djup infiltrering av polymorfonukleära celler eller neutrofiler som deponerar en repertoar av antimikrobiella proteiner, inklusive S100A12, vid infektionsstället 18 , 24 , 25 . I ett försök att förstå den komplexa dialogen mellan värd och patogen, försökte vi förfina tekniken för att rena S100A12 och använda den för att studera den antimikrobiella påverkan den utövar på denna medicinskt relevanta patogen. Protokollet nedan beskriver en förbättrad teknik för S100A12-rening i sitt biologiskt aktiva tillstånd; Kunna binda näringsmetaller med hög affiniTy och chelatera dem bort från invaderande mikroorganismer. Vidare markerar metoderna nedan nyttan av detta protein som ett kritiskt reagens för att studera mekanismen genom vilken medfödda antimikrobiella molekyler begränsar tillväxten av bakteriella patogener.
S100A-familjeproteiner har fått uppskattning som en viktig grupp av medfödda immunsystemmolekyler som deltar i immunförsvar samt värdförsvar 27 . De mest väl studerade av dessa är calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin är ett neutrofilt associerat protein som bildar en heterodimer av S100A8- och S100A9-subenheterna som binder övergångsmetaller vid dimergränssnittet 31 . Kalprotektin har visat sig ha två metallbindningsställen: Ställe 1 kan binda Zn 2+ , Mn 2+ eller Fe 2+ och Site 2 kan Bind Zn 2+ 31 , 32 . Många rapporter har visat att calprotectin har antimikrobiella aktiviteter mot olika patogener, inklusive Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli och H. pylori , och att de inhiberande effekterna beror på metallkeleringsaktiviteten hos calprotectin 25 , 28 , 29 .
Tidigare arbete visat sig kalprotektin utövar många aktiviteter på H. pylori, inklusive förändring av lipid A-strukturen i yttermembranet, undertryckande av cag- TYP IV-sekretionssystemet (vilket är en stor proinflammatorisk virulensfaktor inom H. pylori ), inducerar biofilmbildning och undertrycker H. pylori tillväxt och lönsamhet på ett dosberoende sättClass = "xref"> 25 , 33 . Vidare avslöjade genetiska och biokemiska analyser den antibakteriella aktiviteten hos kalprotektin mot H. pylori till stor del härleddes från dess förmåga att binda näringszink 25 . H. pylori kräver zink, vilket bestämdes av tidigare forskning, som utnyttjade ett kemiskt definierat medium för att fastställa mikronäringsämneskraven för denna patogen att växa och proliferera 34 . Dessutom var calprotectin mycket rikligt inom H. pylori- infekterade vävnader och associerade med neutrofila infiltrat, vilket indikerar att värden kan använda kalprotektin som en antimikrobiell strategi under infektion och efterföljande inflammation 25 , 35 .
Nyliga bevis från objektiva proteomics screeningstekniker antyder att under betingelser där reaktiva syrearter är rikliga, kalprotecTenn genomgår post-translationella modifieringar som förändrar hexa-histidinbindningsstället och därmed hämmar den metallbindande aktiviteten hos proteinet 36 . Som sådan förutsåg vi att andra S100A-familjeproteiner bland den breda repertoaren av dessa molekyler potentiellt kan fungera som hjälpmetallkelatorer. Vi valde S100A12 för vidare studier eftersom den inte identifierades i ovannämnda skärm för posttranslationell modifiering, den har kapacitet att binda zink och det är mycket rikligt i humana vävnader härrörande från H. pyloriinfekterade individer.
Vårt arbete indikerar att S100A12 kan hämma H. pylori- tillväxt och livskraft på ett dosberoende sätt i G27-stammen av H. pylori , och att den antimikrobiella aktiviteten hos detta protein kan reverseras genom tillsats av överskott av näringssänkt zink. Detta arbete kompletterar vårt tidigare arbete som indikerar S100A12 utövat antimikrobiell aktivitet mot PMSS1 och 7.13-stammar av H. pylori , som demonstrerar sin breda antibakteriella aktivitet mot många kliniska isolat och laboratorieanpassade stammar av H. pylori 18 . Tillsammans bekräftar dessa resultat betydelsen av S100A12 som en mekanism för att kontrollera bakteriell tillväxt och proliferation via näringsförmåga. Framtida studier av denna viktiga värd-bakteriella interaktion kan innefatta utnyttjande av aktiviteten av S100A12 för att minska bakteriell börda i värdvävnader eller bestämning av detta proteins bidrag till immun-signalering i samband med H. pylori- infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett effektivt protokoll för både uttryck och rening av humant S100A12 presenteras. E. coli- expressionssystemet är det vanligaste verktyget som används för framställning av rekombinanta proteiner, särskilt när mängder krävs för biokemiska och biofysiska studier. En nyckelförbättring av proceduren som beskrivs här är användningen av auto-induktionsmedium 26 som ökar utbytet av renat protein med en faktor på nästan trettio jämfört med uttryck med standard Luria-buljong…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Department of Veterans Affairs Karriärutvecklingspris 1IK2BX001701, CTSA-pris UL1TR000445 från National Center for Advancing Translational Sciences, National Science Foundation Award Numbers 1547757 och 1400969, och NIH bevilja GM05551. Dess innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis officiella synpunkter på National Center for Advancing Translational Sciences eller National Institutes of Health.
Materials
| S100A12 Expression | ||
| Expression cells | ||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
| Autoinduction medium components | ||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
| Selection agent | ||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
| S100A12 Purification | ||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
| H. pylori Culture | ||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
| Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
Referências
- Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
- Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).
- Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).
- Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
- Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).
- Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).
- Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).
- Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
- Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).
- Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).
- Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).
- Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).
- Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).
- Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).
- Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).
- Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).
- de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).
- Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).
- Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).
- Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
- Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).
- Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).
- Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).
- Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).
- Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
- Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).
- Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).
