Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em> Staphylococcus aureus</em

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor extractie van metabolieten van Staphylococcus aureus en de daaropvolgende analyse via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.

Abstract

In een poging om bacteriële pathogenen te dwarsbomen, hosts beperken vaak de beschikbaarheid van voedingsstoffen op de plaats van infectie. Deze beperking kan de abundanties van de belangrijkste metabolieten waaraan regulerende factoren te reageren, het aanpassen van cellulaire metabolisme te veranderen. In de afgelopen jaren is een aantal eiwitten en RNA zijn gekomen als belangrijke regulatoren van genexpressie virulentie. Bijvoorbeeld, de CodY eiwit reageert hoeveelheden vertakte aminozuren en GTP en wordt veel geconserveerd bij lage G + C Grampositieve bacteriën. Als globale regulator in Staphylococcus aureus, CodY de expressie van tientallen virulentie en metabole genen. Onze hypothese is dat S. aureus gebruikt CodY, voor een deel, aan de metabole toestand te veranderen in een poging aan te passen aan voedingsstoffen randvoorwaarden potentieel aangetroffen in de nieuwe omgeving. Dit manuscript beschrijft een werkwijze voor de extractie en analyse van metabolieten van S. aureus met behulp van vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrietrometry, een protocol dat is ontwikkeld om deze hypothese te testen. De werkwijze wijst ook beste praktijken die zorgt voor nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid, zoals het behoud van biologische stabiele en voortdurende beluchting zonder het gebruik van continue chemostaatcultures. Ten opzichte van de USA200 methicilline-gevoelige S. aureus isolaat UAMS-1 uitgangsstam, de isogene mutant Cody vertoonden significante verhogingen van aminozuren afgeleid van aspartaat (bijvoorbeeld threonine en isoleucine) en afnamen in hun precursors (bijvoorbeeld aspartaat en O -acetylhomoserine ). Deze resultaten correleren goed met transcriptionele gegevens verkregen met RNA-seq analyse: genen in deze trajecten werden opgereguleerd tussen 10- en 800-voudig in Cody null-mutant. Koppeling globale analyse van de transcriptoom en het metaboloom kan onthullen hoe bacteriën veranderen hun metabolisme wanneer zij worden geconfronteerd met het milieu of nutritionele stress, het verstrekken van potentiële inzicht in de physiological veranderingen in verband met een tekort aan nutriënten ervaren tijdens infectie. Dergelijke ontdekkingen de weg voor de ontwikkeling van nieuwe anti-infectieuze middelen en therapeutische middelen vrijmaken.

Introduction

Bacteriële pathogenen te kampen met vele uitdagingen in de nieuwe omgeving. Naast directe aantasting door immuuncellen, de gastheer sekwestreert ook voedingsstoffen die essentieel zijn voor bacteriële overleving en replicatie, genereren nutritionele immuniteit ^{1, 2.} Om deze vijandige omgeving te overleven, bacteriële ziekteverwekkers implementeren virulentiefactoren. Sommige van deze factoren kan de bacterie om de immuunrespons te ontwijken; Andere factoren zijn uitgescheiden spijsverteringsenzymen, zoals hyaluronidase, thermonuclease en lipase, waarbij de bacteriën in staat kan stellen ontbrekende voedingsstoffen aan te vullen door de consumptie van weefsel afgeleide bestanddelen ^{3, 4, 5.} Sterker nog, bacteriën regulerende systemen die de fysiologische toestand van de cel te binden aan de productie van virulentiefactoren ^{6, 7 geëvolueerd,} <s up class = "xref"> ^{8, 9, 10.}

Een groeiende hoeveelheid bewijs wijst op CodY als kritische regulator koppelen metabolisme en virulentie. Hoewel in Bacillus subtilis eerst ontdekt als een repressor van het dipeptide permease (dpp) -gen ^11, is CodY nu bekend dat door vrijwel alle lage G + C Gram-positieve bacteriën ^{12, 13} en regelt tientallen genen betrokken bij koolstof en stikstofmetabolisme ^{14, 15, 16, 17, 18, 19.} In pathogene species, CodY bestuurt ook de expressie van een aantal van de belangrijkste virulentiegenen ^{20, 21,}. ef '> ^{22, 23, 24, 25, 26, 27} CodY wordt geactiveerd als een DNA-bindend eiwit door twee klassen van liganden: vertakte aminozuren (BCAA, isoleucine, leucine en valine [ILV]) en GTP . Wanneer deze voedingsmiddelen zijn overvloedig, CodY onderdrukt (of in sommige gevallen, stimuleert) transcriptie. Al deze voedingsstoffen beperkter is CodY activiteit geleidelijk verminderd, waardoor een gegradeerde transcriptionele respons die omleidt precursoren via verschillende metabolische wegen verbonden centraal metabolisme ^{28, 29, 30.}
Tandem vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) is een techniek die nauwkeurig kan identificeren en kwantificeren van kleine moleculen intracellulaire metabolieten ^31. In combinatie met Transcriptome analyse (bijvoorbeeld RNA-Seq) Dit analytisch workflow inzicht in de fysiologische veranderingen die optreden in reactie op milieu- of nutritionele stress. Hier presenteren we een methode voor het metaboliet extractie uit Staphylococcus aureus cellen en daaropvolgende analyse door LC-MS. Deze benadering is gebruikt om de pleiotrope effecten van CodY op S. aureus fysiologie aan te tonen.

Protocol

1. Voorbereiding van de Buffer Solutions Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) door verdunning van een voorraadoplossing van 10x PBS tot een eindconcentratie van 1 x met ultrazuiver (gedestilleerd en gedeïoniseerd) water. Bereid quenching oplossing combineert 2 ml acetonitril, 2 ml methanol, 1 ml ultrazuiver H2O en 19 pl (0,1 mM eindconcentratie) mierenzuur. Bereid LC-MS oplosmiddel A door toevoeging van mierezuur (0,2% [v / v] eindconcentratie) met ultrazuiver …

Representative Results

We hebben intracellulaire metaboliet zwembaden in S. aureus geanalyseerd tijdens de in vitro groei in een rijke, complexe medium. Als bewijs van het principe, vergeleken we metabolietprofielen tussen de methicilline-gevoelige S. aureus osteomyelitis isoleren UAMS-1 (wildtype [WT]) en een isogene stam zonder de globale transcriptionele regulator CodY (Δ Cody) 26. Steady-state, exponentiële kweken van de WT en Cody stam…

Discussion

Alle kleine moleculen metabolieten zijn met elkaar verbonden via hun gemeenschappelijke oorsprong in centrale metabole routes. Tijdens exponentiële groei, bacteriële cellen in biologische en metabolische steady state, die een momentopname van de fysiologische toestand onder specifieke omstandigheden. CodY controleert voedingsstoffen voldoende door te reageren op ILV en GTP. Als ILV en GTP zwembaden druppel wordt CodY verricht waardoor geleidelijk verlaagd, het aanpassen van de expressie van de doelwitgenen te passen a…

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml)	Belco	2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml	Pyrex	5340
3-hole Rubber Stopper, #7	Fisher	14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit	VWR	89428-936
Petri Dish, 35 mm	Corning	430588	Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size	Millipore	GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml	USA Scientific	1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Cogent Diamond hydride type C column	Agilent	70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series	Agilent	G6230B
Quat Pump, 1290 Series	Agilent	G4204A
Bin Pump, 1290 Series	Agilent	G4220A
Valve Drive, 1290 Series	Agilent	G1107A
Isocratic Pump, 1290 Series	Agilent	G1310B
TCC, 1290 Series	Agilent	G1316C
Sampler, 1290 Series	Agilent	G4226A
Thermostat, 1290 Series	Agilent	G1330B
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, Granulated	Becton Dickinson	214530	Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X	Ambion	AM9624	Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Methanol	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS; toxic
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318	For mass spectrometry, 98%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Bacterial Strain	Species	Strain	Genotype
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	wild type
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.