Aqui descrevemos um método de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco ao caseu de lesões e cavidades de tuberculose pulmonar. O protocolo também é usado com uma matriz espumosa derivada de macrófagos que é um substituto efetivo do caseu.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A erradicação da tuberculose requer regimes medicamentosos que possam penetrar as múltiplas camadas de lesões pulmonares complexas. A distribuição de fármacos nos núcleos caseosos de cavidades e lesões é especialmente crucial porque abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a fármacos também vulgarmente referidas como persisters. Os métodos existentes para a medição da penetração de fármaco em lesões de tuberculose envolvem costosos e demorados estudos farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas ou de imagem. A medida in vitro da ligação do fármaco às macromoléculas de caseu foi proposta como uma alternativa a essas técnicas, uma vez que esta ligação dificulta a difusão passiva de moléculas de fármaco através do caseu. A diálise de equilíbrio rápido é um sistema rápido e confiável para realizar estudos de ligação a proteínas plasmáticas e tecidos. Neste protocolo, usamos um dispositivo de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco a homogenatos de caseu que é excised das lesões e as cavidades de coelhos infectados com tuberculose. O protocolo também descreve como gerar uma matriz de substituição de lípido carregado THP-1 macrófagos para usar em lugar de caseum. Este ensaio de ligação caseum / substituto é uma ferramenta importante na descoberta de drogas tuberculose e pode ser adaptado para ajudar o estudo da distribuição de drogas em lesões ou abcessos causados por outras doenças.
Introdução
O tratamento da doença pulmonar tuberculosa requer distribuição eficaz de fármacos em diferentes tipos de lesões. As lesões necróticas e as cavidades contêm centros caseosos que abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a drogas ou "persistentes". 1 , 2 A doença cavitária está associada a taxas de cura inferiores e mau prognóstico. 3 , 4 Estudos anteriores mostraram, usando técnicas quantitativas e de imagem, que a capacidade de penetrar o caseu varia significativamente de uma classe de droga para outra. 5 ,
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Protocolo
Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde com a aprovação do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso do NIAID (NIH), Bethesda, MD. Todos os estudos envolvendo o M. tuberculosis foram realizados num laboratório com nível de segurança biológica de contenção 3 (BSL-3).
Modelo Infecção 1. Coelho e Coleção caseum
- Infect de coelhos Nova Zelândia brancos com M. tuberculosis usando um sistema de exposição de aerossóis só de nariz, como descrito anteriormente. 12,
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Resultados
Usando este protocolo, testámos centenas de compostos de desenvolvimento de tuberculose para a sua eficiência previsto no penetrante caseum. A Figura 1 visualiza os conceitos básicos do ensaio VERMELHO. A membrana de diálise das inserções VERMELHOS permite para pequenas moléculas não ligadas a difundir a partir do dador bem ao receptor bem como, finalmente, atingir um equilíbrio entre os dois compartimentos. As pequenas moléculas que são ligadas a macromoléculas, tais co.......
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Discussão
Lesões necróticas pulmonares e cavidades em pacientes infectados com tuberculose contêm subpopulações de bactérias que são recalcitrantes ao tratamento medicamentoso. Os núcleos caseosos destas estruturas são particularmente responsáveis por abrigar estes persisters em um ambiente extracelular. Acredita-se que uma distribuição favorável de agentes anti-bacterianos nestes locais remotos seja um determinante importante da eficácia do fármaco contra a tuberculose. Antes da validação deste protocolo, não havia técnicas
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Divulgações
Não existem interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Desejamos agradecer à Johnson & Johnson, à TB Alliance, à Astra Zeneca, à Rib-X e à Trius Therapeutics pela prestação de bedaquilina, PA-824 (pré-tonsanida), AZD5847, radezolid e tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li e Danielle Weiner forneceram suporte com análise MALDI, métodos bioanalíticos, preparação do substituto caseu, síntese química e isolamento de caseum de coelho. Este trabalho foi realizado com financiamento da Fundação Bill e Melinda Gates, o prêmio # OPP1044966 e OPP1024050 para V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, bem como o financiamento conjunto da F....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Coelhos brancos da Nova Zelândia | |||
| Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Cetatesia (Cetamina) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Saúde Animal | 56344 | |
| Anased (Xilazina) 100 mg/mL | Henry Schein Saúde Animal | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sódico e fenitoína sódica) Solução | Virbac | 710101 | |
| linha celular monocítica THP-1 | ATCC ATCC | TIB-202 | |
| 175 cm² Cantil Tratado com TC (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 mídia sem glutamina | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Irradiado por Gama | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamina, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| prato Cellstar TC, 145 mm x 20 mm, ventilado | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético | Sigma | E6758 | |
| Ácido oleico | Placa | do Dispositivo Fisher Scientific ICN15178101 | |
| Pierce RED | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Insertos de Dispositivo Pierce RED, 50/caixa | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED | Fisher Scientific | 89812 | |
| Vedação de placa adesiva | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Tecnologias de Vida | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrila | Sigma | 34998 | |
| Metanol | Sigma | 34860 | |
| Cloridrato de Verapamil | Sigma | V4629 | |
| Sal de diclofenaco de sódio | Sigma | 93484 | |
| Solução de azul de tripano, 0,4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Etanol, 200 provas | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Acessório de Homogeneizador de Moinho de Contas, Contas de Metal a Granel | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalto 60 Irradiador | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO Hemacitômetros descartáveis C-Chip | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Microscópio de luz vertical | Leica | DM1000 | |
| Sistema de cromatografia líquida binária | Agilent | 1260 | |
| Espectrômetro de massa | AB Sciex | 4000 |
Referências
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Fron....
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Reimpressões e permissões
