Mesure de la signalisation des récepteurs couplés à la protéine G via liaison GTP radiomarquée
Summary
La liaison à la guanosine triphosphate (GTP) est l'un des premiers événements dans l'activation du récepteur couplé aux protéines G (GPCR). Ce protocole décrit comment caractériser pharmacologiquement des interactions spécifiques de GPCR-ligand en surveillant la liaison de l'analogue GTP radio-marqué, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), en Réponse à un ligand d'intérêt.
Abstract
Les récepteurs couplés à la protéine G (GPCR) sont une grande famille de récepteurs transmembranaires qui jouent un rôle critique dans la physiologie cellulaire normale et constituent une cible pharmacologique majeure pour de multiples indications, y compris l'analgésie, la régulation de la pression artérielle et le traitement des maladies psychiatriques. Lors de la liaison au ligand, les GPCR catalysent l'activation des protéines G intracellulaires en stimulant l'incorporation du guanosine triphosphate (GTP). Les protéines G activées stimulent alors les voies de signalisation qui provoquent des réponses cellulaires. La signalisation GPCR peut être surveillée en mesurant l'incorporation d'une forme radiomarquée et non hydrolysable de GTP, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), en protéines G. Contrairement à d'autres méthodes qui évaluent plus de processus de signalisation en aval, [ 35 S] GTPγS binding mesure un événement proximal dans la signalisation GPCR et, surtout, peut distinguer l'agonisTs, antagonistes et agonistes inverse. Le présent protocole décrit une méthode sensible et spécifique pour l'étude de la signalisation GPCR en utilisant des préparations à membrane brute d'un GPCR archétypal, le récepteur μ-opioïde (MOR1). Bien qu'il existe des approches alternatives pour le fractionnement des cellules et des tissus, beaucoup sont coûteuses, fastidieuses et / ou nécessitent des équipements de laboratoire non standard. La présente méthode fournit une procédure simple qui enrichit les membranes brutes fonctionnelles. Après avoir isolé MOR1, diverses propriétés pharmacologiques de son agoniste, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) et antagoniste, naloxone, ont été déterminées.
Introduction
Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont une grande famille de récepteurs de surface cellulaire responsables d'une gamme remarquable de processus physiologiques, y compris l'analgésie, l'olfaction et le comportement 1 . Les GPCR agissent en détectant des signaux externes spécifiques et en stimulant ensuite la signalisation intracellulaire. Ils marquent donc une jonction clé entre les environnements externe et interne d'une cellule. En raison du rôle critique que jouent les GPCR dans la biologie, ils sont devenus des cibles majeures pour la recherche fondamentale et la découverte de médicaments 2 , 3 .
Contrairement à d'autres familles de récepteurs qui se lient à des ligands discrets, les GPCR peuvent lier des molécules très différentes. Alors qu'un GPCR peut interagir avec des peptides, un autre peut détecter les photons, les petites molécules ou les ions 1 , 4 . Bien que leurs ligands soient diversifiés, les GPCR sont unifiés dans leur architecte généralUre et fonction. Les GPCR individuels sont constitués de sept protéines transmembranaires α-hélicoïdales avec des terminaux amino extracellulaires et des terminaux carboxyle intracellulaires 5 , 6 . Les GPCR sont couplés aux protéines G intracellulaires – complexes de protéines hétérotrimères composés de sous-unités α, β et γ – qui opèrent sur différentes voies de signalisation 7 . La sous-unité G α est une protéine de liaison aux nucléotides de guanine qui est inactif lorsqu'elle est liée au diphosphate de guanosine (PIB) et active lorsqu'elle est liée au guanosine triphosphate (GTP) 8 , 9 . Lorsque les GPCR lient leurs ligands, ils subissent un changement conformationnel qui permet à G α de se dissocier de G βγ , permettant ainsi à G α d'échanger le PIB pour GTP 7 . Le récepteur lui-même est phosphorylé à son extrémité carboxyle par divers serine / threonIne kinases 10 , 11 et internalisées pour atténuer la signalisation du récepteur 12 , 13 , 14 . Pendant ce temps, le monomère G α activé et le dimère G βγ procèdent à l'activation de voies de signalisation distinctes 7 . Il existe plusieurs isoformes de chaque sous-unité de protéine G, et chaque isoforme cible des voies en aval et des systèmes de messagerie secondaire particuliers. Les principales isoformes de G α comprennent G s , G q , G i / o et G 12-13 . Généralement, les GPCR individuels s'associaient à une isoforme G α particulière, reliant ainsi un stimulus externe à une réponse cellulaire spécifique 1 .
La caractérisation d'une interaction GPCR-ligand est essentielle pour comprendre la biologie du récepteur. Comme l'échange de PIB / GTP est l'une des premières veilleNts qui suit la liaison du ligand, la surveillance de la liaison GTP peut mesurer l'activation ou l'inhibition du GPCR. L'analyse de plus d'événements en aval dans la signalisation GPCR n'est souvent pas aussi quantitatif ni stoechiométrique, peut ne pas distinguer les agonistes complets de ceux partiels et peut nécessiter des réactifs coûteux. En outre, l'augmentation de la liaison GTP aux protéines G α est un événement presque universel suite à l'activation du GPCR, ce qui signifie que la mesure de la liaison GTP est un dosage largement applicable pour le suivi de l'activité de la plupart des GPCR. La mesure de la liaison GTP est une approche simple et rapide pour surveiller la signalisation GPCR dans les cellules surexprimant le récepteur d'intérêt ou dans le tissu indigène. Le présent protocole détaille un dosage fonctionnel de liaison GTP en utilisant un GPCR archétypal, le récepteur μ-opioïde (MOR1), pour déterminer quantitativement l'activité d'un agoniste et d'un antagoniste sur la signalisation GPCR.
Ce protocole décrit d'abord comment isoler les membranes brutes des cellules qui surexpriment MOR1. Notez queCe protocole ne se limite pas aux systèmes de surexpression et peut être appliqué à de nombreuses sources de membrane, y compris des tissus indigènes ou des préparations exprimant des récepteurs multiples et des protéines G 15 . Le protocole détaille ensuite comment mesurer la liaison d'un analogue GTP radioactif à ces membranes en réponse à des concentrations variables de [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) ou de naloxone, un agoniste et antagoniste MOR1, respectivement. L'analogue GTP, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS) n'est pas hydrolysable. Cette propriété est critique parce que les sous-unités G α présentent une activité GTPase intrinsèque 7 et élimineraient le phosphate gamma marqué sur un radiochimique GTP hydrolysable. Les membranes sont ensuite piégées sur des filtres à fibres de verre et lavées, après quoi le GTP radiomarqué est quantifié par comptage par scintillation liquide. Des paramètres pharmacologiques multiples peuvent être dérivés pour caractériserE l'interaction récepteur-ligand, y compris la réponse demi-maximale (EC 50 ) et le coefficient Hill (n H ) pour les agonistes et la concentration inhibitrice demi-maximale (IC 50 ) et la constante de dissociation à l'équilibre (K b ) pour les antagonistes 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent protocole décrit deux méthodes distinctes mais complémentaires: une approche simple pour fractionner les cellules et les tissus dans des compartiments larges mais distincts et un moyen d'étudier la signalisation GPCR en mesurant la liaison [ 35 S] GTPγS.
Le fractionnement cellulaire efficace a une large gamme d'applications, allant de l'extraction et l'enrichissement des protéines, à l'évaluation de la localisation subcellulaire des protéin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention DA-000266 des instituts nationaux de la santé et la subvention T32 du programme de formation des scientifiques scientifiques (CV, NWZ et PCS). Les auteurs souhaiteraient également reconnaître somersault18: 24 (somersault1824.com) pour la Bibliothèque des Sciences et des Illustrations médicales.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
Referências
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5′-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin – Number of Phosphorylation Sites. Bioquímica. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5′-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- Sittampalam, G. S., et al. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
