무선 표지 된 GTP 결합을 통한 G- 단백질 결합 수용체 신호 측정
Summary
Guanosine triphosphate (GTP) 결합은 G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) 활성화에서 가장 초기의 사건 중 하나이다. 이 프로토콜은 방사성 표지 된 GTP 유사체 [ 35 S] 구아노 신 -5'-O- (3- 티오) 트리 포스페이트 ([ 35 S] GTPγS)의 결합을 모니터링함으로써 특정 GPCR- 리간드 상호 작용을 약리학 적으로 특성화하는 방법을 설명합니다. 관심있는 리간드에 대한 반응.
Abstract
G- 단백질 결합 수용체 ( G-Protein-Coupled Receptor , GPCRs)는 정상적인 세포 생리학에서 중요한 역할을하는 막 투석 수용체의 큰 계열이며 진통, 혈압 조절 및 정신병 치료와 같은 여러 적응증의 주요 약리학 적 표적을 구성합니다. 리간드 결합시, GPCR은 구아 노신 트리 포스페이트 (GTP)의 혼입을 자극하여 세포 내 G- 단백질의 활성화를 촉매한다. 활성화 된 G- 단백질은 세포 반응을 유도하는 신호 전달 경로를 자극합니다. GPCR 시그널링은 G- 단백질로 [ 35 S] 구아노 신 -5'-O- (3- 티오) 트리 포스페이트 ([ 35 S] GTPγS)의 방사성 표지 및 비 가수 분해성 형태의 결합을 측정함으로써 모니터 할 수있다. 더 많은 하류 신호 전달 과정을 평가하는 다른 방법과 달리, [ 35 S] GTPγS binding은 GPCR 신호 전달에서 근위 사건을 측정하며, 중요하게는,ts, 길항제 및 역작용 제를 포함한다. 현재의 프로토콜은 원형 GPCR, μ-opioid 수용체 (MOR1)의 조질 막 준비를 사용하여 GPCR 신호를 연구하기위한 민감하고 구체적인 방법을 개략적으로 설명합니다. 세포와 조직을 분별하는 대안적인 방법이 있지만, 비용이 많이 들고, 지루하고, 비표준 실험 장비가 필요합니다. 본 방법은 기능성 조 (crude) 막을 풍부하게하는 간단한 절차를 제공한다. MOR1을 분리 한 후, 그 작용제 인 [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] – 엔케팔린 (DAMGO) 및 길항제 인 나록 손의 다양한 약리학 적 성질을 결정 하였다.
Introduction
G- 단백질 결합 수용체 (G-Protein-Coupled Receptor, GPCRs)는 진통, 후각 및 행동을 포함하여 현저한 일련의 생리 학적 과정을 담당하는 세포 표면 수용체의 큰 계열입니다. GPCR은 특정 외부 신호를 감지하고이어서 세포 내 신호를 자극함으로써 작동합니다. 따라서 그들은 세포의 외부 환경과 내부 환경 사이의 주요 연결점을 표시합니다. GPCR이 생물학에서 중요한 역할을하기 때문에, 그들은 기초 연구와 약물 발견 둘 다에 대한 주요 표적이되었다.
이산 리간드에 결합하는 다른 수용체 계열과 달리 GPCR은 매우 다른 유형의 분자에 결합 할 수 있습니다. 하나의 GPCR은 펩타이드와 상호 작용할 수 있지만, 다른 GPCR은 펩티드와 상호 작용할 수 있지만, 다른 GPCR은 펩티드와 상호 작용할 수 있습니다. 그들의 리간드가 다양하지만, GPCR은 전체 건축가에게 통일되어 있습니다.기능 및 기능. 개별 GPCR은 세포 외 아미노 말단과 세포 내 카르 복실 말단을 갖는 7 개의 α 헬리컬 막 횡단 단백질로 이루어져있다. GPCR은 α, β 및 γ 서브 유닛으로 구성된 세포 내 G- 단백질 – 헤테로 트리 메릭 단백질 복합체와 결합되어 다양한 신호 전달 경로를 매개한다. G α 서브 유닛은 구아노 염기 결합 단백질로 guanosine diphosphate (GDP)에 결합 할 때 불활성이고 guanosine triphosphate (GTP) 8,9에 결합 될 때 활성화된다. GPCR이 리간드에 결합 할 때 Gα가 Gβγ로부터 해리되어 Gα가 GTP와 GTP를 교환 할 수 있도록하는 구조 변화가 일어난다. 수용체 그 자체는 다양한 세린 / 트레온에 의해 그의 카르 복실 말단에서 인산화된다ine 키나아제 10 , 11 및 내재화되어 수용체 신호 전달을 약화시킨다 12 , 13 , 14 . 한편 활성화 된 G α 모노머와 G βγ 이합체는 별개의 신호 전달 경로를 활성화시킵니다. 각 G 단백질 subunit에는 여러 가지 isoform이 있으며 각 isoform은 특정 하류 경로와 2 차 메신저 시스템을 대상으로합니다. 주요 G α isoforms에는 G s , G q , G i / o 및 G 12-13이 포함 됩니다. 전형적으로, 개별 GPCR은 특정 G α 이소 형과 결합하여, 외부 자극을 특정 세포 반응 1에 연결 시킨다.
GPCR- 리간드 상호 작용을 특성화하는 것은 수용체의 생물학적 특성을 이해하는 데 중요합니다. GDP / GTP 교환은 초기 이브 중 하나입니다.GTF 결합을 모니터링하는 것은 GPCR 활성화 또는 저해를 측정 할 수있다. GPCR 신호 전달에서 더 많은 하류 현상을 정량하는 것은 정량적 또는 화학량 론적이지 않은 경우가 많으며 전체 작용제를 부분적으로 구별하지 못할 수 있으며 값 비싼 시약이 필요할 수 있습니다. 또한, G α 단백질에 대한 증가 된 GTP 결합은 GPCR 활성화 후 거의 보편적 인 사건이며, 이는 GTP 결합을 측정하는 것이 대부분의 GPCR의 활성을 모니터링하기위한 널리 적용 가능한 분석임을 의미한다. GTP 결합 측정은 관심있는 수용체 또는 토착 조직을 과발현하는 세포에서 GPCR 신호 전달을 모니터링하는 간단하고 신속한 접근법입니다. 본 프로토콜은 GPCR 신호 전달 물질에 작용제와 길항제의 활성을 정량적으로 결정하기 위해 μ-opioid 수용체 (MOR1) 인 archetypal GPCR을 사용하여 기능적 GTP 결합 분석을 상세히 설명합니다.
이 프로토콜은 먼저 MOR1을 과발현하는 세포로부터 조막 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 주의 그쪽으로이 프로토콜은 과발현 시스템에 국한되지 않으며, 다중 수용체 및 G 단백질을 발현하는 천연 조직 또는 제제를 비롯한 많은 막 원천에 적용될 수있다. 프로토콜은 다양한 농도의 [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] – 엔케팔린 (DAMGO) 또는 날 록손 (MOR1 작동 제 및 길항제)에 반응하여 방사성 GTP 유사체의 이들 막에 대한 결합을 측정하는 방법을 상술하고, 각기. GTP 유사체 인 [ 35 S] guanosine-5'-O- (3- thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS)는 가수 분해되지 않는다. G α 서브 유닛은 내재적 인 GTPase 활성을 나타내며 가수 분해 가능한 GTP 방사성 화학 물질에서 표지 된 감마 인산염을 제거하기 때문에이 특성은 중요합니다. 멤브레인을 유리 섬유 필터에 트랩하고 세척 한 후, 방사성 표지 된 GTP를 액체 섬광 계수로 정량화합니다. 여러 약리학 적 매개 변수를 특성에 맞게 유도 할 수 있습니다.길항제 16, 17에 대한 작용제에 대한 절반 최대 반응 (EC 50 ) 및 Hill 계수 (n H ) 및 반감기 최대 억제 농도 (IC 50 ) 및 평형 해리 상수 (K b )를 포함하는 수용체 – , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
현재의 프로토콜은 세포와 조직을 넓고 구별되는 구획으로 나누는 간단한 접근법과 [ 35 S] GTPγS 결합을 측정하여 GPCR 신호 전달을 조사하는 수단 인 두 가지 분리 된 그러나 보완적인 방법을 기술한다.
효율적인 세포 분획 화는 단백질의 추출 및 농축에서 단백질의 세포 내 지방화 평가, 수용체 약리학 연구에 이르기까지 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. 세포?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 National Institutes of Health 보조금 DA-000266 및 Medical Scientist Training Program T32 보조금 (CV, NWZ 및 PCS)에 의해 지원되었습니다. 저자는 또한 과학 및 의료 삽화의 도서관에 대한 somersault1824 (somersault1824.com)을 인정하고자합니다.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
Referências
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