Um Ensaio de Blot de Ponto de 5 mC Quantificando o N�el de Metila�o de ADN da Dediferencia�o de Condrocitos<em> In Vitro</em
Summary
Apresentamos um método para quantificar a metilação do DNA com base na mancha ponto 5-metilcitosina (5-mC). Determinamos os níveis de 5-mC durante a desdiferenciação de condrócitos. Esta técnica simples poderia ser usada para determinar rapidamente o fenótipo condrócito em tratamento com ACI.
Abstract
A desdiferenciação de condrócitos hialinos em condrócitos fibroblásticos acompanha frequentemente a expansão monocamada de condrócitos in vitro . O nível global de metilação do ADN dos condrócitos é considerado um biomarcador adequado para a perda do fenótipo dos condrócitos. No entanto, resultados baseados em diferentes métodos experimentais podem ser inconsistentes. Portanto, é importante estabelecer um método preciso, simples e rápido para quantificar os níveis globais de metilação do DNA durante a desdiferenciação dos condrócitos.
As técnicas atuais de análise de metilação do genoma abrangem amplamente o seqüenciamento genômico do bisulfito. Devido à degradação do ADN durante a conversão de bissulfito, estes métodos requerem tipicamente um grande volume de amostra. Outros métodos utilizados para quantificar os níveis globais de metilação do DNA incluem a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). No entanto, a HPLC requer a digestão completa do ADN genómico. Além disso, o custo proibitivamente alto de HPLC emLimita a aplicação mais ampla da HPLC.
Neste estudo, o ADN genómico (gDNA) foi extraído de condrócitos humanos cultivados com número variável de passagens. O nível de metilação de gDNA foi detectado utilizando um ensaio dot blot de metilação específica. Nesta abordagem dot blot, uma mistura de gDNA contendo o ADN metilado a ser detectado foi manchada directamente sobre uma membrana N + como um ponto dentro de um padrão de molde circular previamente desenhado. Em comparação com outras abordagens de blotting baseadas em electroforese em gel e outros processos de transferência de blot, o método dot blot economiza tempo significativo. Além disso, as transferências de pontos podem detectar o nível geral de metilação do ADN utilizando um anticorpo 5-mC comercialmente disponível. Descobrimos que o nível de metilação do DNA diferiu entre as subcultações monocamadas e, portanto, poderia desempenhar um papel chave na desdiferenciação dos condrócitos. A mancha ponto 5-mC é um método confiável, simples e rápido para detectar o nível geral de metilação do DNA para avaliarE fenótipo condrócito.
Introduction
O implante de condrócitos autólogos (IAC) é um procedimento relativamente novo e de última geração para o tratamento de defeitos da cartilagem articular 1 , 2 . Um dos passos cruciais no ACI é a amplificação de condrócitos através da cultura monocamada in vitro . Durante a amplificação, os condrócitos hialinos perdem facilmente o seu fenótipo e se tornam desdiferenciados, o que é indesejável para o tratamento com ACI 3 , 4 . Para optimizar o resultado do tratamento com ACI, a extensão da desdiferenciação dos condrócitos deve ser determinada antes da replantação. É imperativo estabelecer uma maneira econômica e rápida de determinar o status dos condrócitos. Recentemente, a associação entre metilação do DNA e desdiferenciação de condrócitos atraiu muita atenção 4 , 5 , 6 . A metilação do DNA é um processoGrupos metilo são adicionados ao ADN, resultando na conversão de resíduos de citosina em 5-metilcitosina (5-mC).
Para elucidar a biologia da metilação do DNA na desdiferenciação dos condrócitos, o primeiro passo é avaliar o nível de metilação do DNA dos condrócitos, que até agora tem se mostrado desafiador. A sequenciação genômica do bisulfito é a técnica mais utilizada para analisar a metilação do DNA 7 , 8 . Neste ensaio, a conversão de bisulfito provoca a degradação do ADN, e assim uma quantidade substancial de amostra deve ser proporcionada para o ensaio. Além disso, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi utilizada para quantificar os níveis globais de metilação do DNA 9,10. No entanto, a análise por HPLC requer digestão com ADN genómico. Além disso, são necessários instrumentos experimentais avançados e caros. Portanto, além do alto custo, esses procedimentos experimentais são contra-tempoUming Os anticorpos anti-5-mC tornaram-se agora comercialmente disponíveis, o que criou a possibilidade de imunotransferência de ADN genómico contendo 5 mC a partir de genomas complexos.
Neste relatório, extraímos DNA genômico de condrócitos cultivados em uma série de culturas monocamadas. Utilizou-se um ensaio dot blot para avaliar o teor de 5-mC em condrócitos humanos com diferentes números de passagens. Verificou-se que o teor de 5-mC foi aumentado em condrócitos altamente desdiferenciados em comparação com condrócitos com desdiferenciação de baixo grau. Além disso, identificamos uma relação entre o status de desdiferenciação e os níveis de 5-mC. Finalmente, relatamos que as alterações no conteúdo de 5 mC foram associadas ao fenótipo condrócito. Deste modo, o ensaio de dot blot de 5 mC é um método fiável, simples e rápido para detectar o nível de metilação do ADN em condrócitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A desdiferenciação de condrócitos in vitro compromete gravemente o desfecho da ACI no tratamento da reparação de defeitos da cartilagem 11,12. Para otimizar o resultado do ACI, é crucial evitar o uso de condrócitos desdiferenciados 13 . Estudos sugeriram que o nível geral de metilação do DNA está associado à extensão da desdiferenciação dos condrócitos 4,6. Assim, é imperativo estabelecer um método fiável e rápido para detectar o estado geral de metilação do ADN dos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções: Natural Science Foundation of China (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); Fundação de ciência natural da província de Guangdong, China (No. 2015A030313772); Projeto financiado da fundação da ciência de Postdoctoral de China (No. 2013M530385); A Fundação de Pesquisa Médica da Província de Guangdong, China (No. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Referências
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