En 5-mC primärblottanalys som kvantifierar DNA-metyleringsnivån av kondrocyt-skillnad<em> In Vitro</em
Summary
Vi presenterar en metod för att kvantifiera DNA-metylering baserat på 5-metylcytosin (5-mC) dot blot. Vi bestämde 5-mC-nivåerna vid chondrocyt dedifferentiering. Denna enkla teknik kan användas för att snabbt bestämma kondrocytfenotypen vid ACI-behandling.
Abstract
Differentiering av hyalinkondrocyter i fibroblastiska kondrocyter följer ofta monoskiktsexpansion av kondrocyter in vitro . Den globala DNA-metyleringsnivån av kondrocyter anses vara en lämplig biomarkör för förlusten av kondrocytfenotypen. Resultaten baserade på olika experimentella metoder kan emellertid vara inkonsekventa. Därför är det viktigt att fastställa en exakt, enkel och snabb metod för att kvantifiera globala DNA-metyleringsnivåer under kondrocytdifferentiering.
Aktuella genomomfattande metyleringsanalysstekniker bygger i stor utsträckning på genom-sekvensering av bisulfit. På grund av DNA-nedbrytning under bisulfitomvandling kräver dessa förfaranden vanligen en stor provvolym. Andra metoder som används för att kvantifiera globala DNA-metyleringsnivåer innefattar högprestandad vätskekromatografi (HPLC). HPLC kräver emellertid fullständig digestion av genomiskt DNA. Dessutom är den förbjudna höga kostnaden för HPLC iStruments begränsar HPLCs bredare tillämpning.
I denna studie extraherades genomiskt DNA (gDNA) från humana kondrocyter odlade med varierande antal passager. GDNA-metyleringsnivån detekterades med användning av en metyleringsspecifik dot-blot-analys. I detta dot-blot-tillvägagångssätt upptäcktes en gDNA-blandning innehållande det metylerade DNA som skulle detekteras direkt på ett N + -membran som en punkt i ett tidigare ritat cirkulärt mallmönster. Jämfört med andra gelelektroforesbaserade blottingsmetoder och andra komplexa blottningsförfaranden sparar dot blot-metoden betydande tid. Dessutom kan prickfläckar detektera den totala DNA-metyleringsnivån med användning av en kommersiellt tillgänglig 5-mC antikropp. Vi fann att DNA-metyleringsnivån skilde sig mellan monoskiktets subkulturer och kunde därför spela en nyckelroll vid kondondrocytdifferentiering. 5-mC dot blot är en pålitlig, enkel och snabb metod för att detektera den allmänna DNA-metyleringsnivån för att utvärderaE kondrocytfenotyp.
Introduction
Autolog chondrocytimplantation (ACI) är ett relativt nytt, state-of-the-art-förfarande för behandling av ledbroskfel 1 , 2 . Ett av de avgörande stegen i ACI är amplifiering av kondrocyter via monolagskultur in vitro . Under amplifiering förlorar hyalinkondrocyterna lätt sin fenotyp och blir dedifferentierad, vilket är oönskat för ACI-behandling 3 , 4 . För att optimera resultatet av ACI-behandling, bör graden av kondrocyt dedifferentiering bestämmas före replantering. Det är absolut nödvändigt att etablera ett ekonomiskt och snabbt sätt att bestämma kondrocyternas status. Nyligen har associeringen mellan DNA-metylering och kondrocytdifferentiering dragit stor uppmärksamhet 4 , 5 , 6 . DNA-metylering är en process av whMetylgrupperna sättes till DNA, vilket resulterar i omvandling av cytosinrester till 5-metylcytosin (5-mC).
För att belysa biologin för DNA-metylering vid kondondrocytdifferentiering är det första steget att utvärdera DNA-metyleringsnivån av kondrocyter, som hittills har visat sig utmanande. Bisulfit genomisk sekvensering är den mest använda tekniken för att analysera DNA-metylering 7 , 8 . I denna analys orsakar bisulfitomvandling DNA-nedbrytning och således måste en väsentlig mängd prov tillhandahållas för analysen. Högprestandad vätskekromatografi (HPLC) har också använts för att kvantifiera globala DNA-metyleringsnivåer 9 , 10 . HPLC-analys kräver emellertid genomisk DNA-digestion. Vidare krävs avancerade och dyra experimentella instrument. Därför är förutom de höga kostnaderna dessa experimentella förfaranden tidsavbrottuming. Anti-5-mC antikroppar har nu blivit kommersiellt tillgängliga, vilket har skapat möjligheten för immunblottning av 5-mC-innehållande genomiskt DNA från komplexa genomer.
I denna rapport extraherades vi genomiskt DNA från kondrocyter odlade i en serie monolagskulturer. Vi använde en dot blot-analys för att utvärdera 5-mC-innehållet i humana kondrocyter med olika antal passager. Vi fann att 5-mC-innehållet ökades i starkt dedifferentierade kondrocyter jämfört med kondrocyter med låg gradig dedifferentiering. Dessutom identifierade vi ett förhållande mellan dedifferentiation status och 5-mC nivåer. Slutligen rapporterade vi att förändringarna i 5-mC-innehåll associerades med kondrocytfenotypen. Därför är 5-mC dot blot-analysen en pålitlig, enkel och snabb metod för att detektera DNA-metyleringsnivån i kondrocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chondrocyt dedifferentiering in vitro kompromissar allvarligt resultatet av ACI vid behandling av bruskdefekter 11 , 12 . För att optimera ACI-resultatet är det avgörande att undvika användningen av dedifferentierade kondrocyter 13 . Studier har föreslagit att den allmänna DNA-metyleringsnivån är associerad med graden av kondrocytdifferentiering 4 , 6 . Det är s?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av följande bidrag: Kinas naturvetenskapliga fonden (nr 81572198; nr 81260161; nr 81000460); Naturvetenskapliga fonden i Guangdong-provinsen, Kina (nr 2015A030313772); Kina Postdoctoral Science Foundation Funded Project (nr 2013M530385); Medical Research Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr A2016314); Shenzhen Vetenskap och teknik Projekt (Nr JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Referências
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
