Ce manuscrit décrit l'efficacité, la livraison non virale de miR aux cellules endothéliales par un vecteur PEI / MNP et leur aimantation. Ainsi, en plus de la modification génétique, cette approche permet d'orientation magnétique des cellules et l'IRM détectabilité. La technique peut être utilisée pour améliorer les caractéristiques des produits thérapeutiques cellulaires.
À ce jour, les traitements chirurgicaux et pharmacologiques disponibles pour les maladies cardiovasculaires (MCV) sont limitées et souvent palliative. En même temps, les thérapies géniques et cellulaires sont des approches alternatives très prometteuses pour le traitement des maladies cardiovasculaires. Cependant, la large application clinique de la thérapie génique est fortement limitée par l'absence de systèmes de délivrance de gènes appropriés. Le développement des vecteurs de transfert de gènes appropriés peut fournir une solution aux défis actuels en thérapie cellulaire. En particulier, les inconvénients existants, tels que l' efficacité limitée et une faible rétention cellulaire dans l'organe blessé, pourrait être surmontée par l' ingénierie cellulaire appropriée (c. -à- génétique) avant la transplantation. Le protocole présenté décrit la modification transitoire efficace et sûr des cellules endotheliales en utilisant une nanoparticule magnétique superparamagnétique polyéthylèneimine (PEI / MNP) de vecteur de délivrance à base de. En outre, l'algorithme et les méthodes de caractérisation des cellules sont définies. Le succès intracellulivraison lar de microARN (miR) dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) a été atteint sans affecter la viabilité des cellules, la fonctionnalité ou la communication intercellulaire. De plus, cette approche a été prouvée pour provoquer un effet fonctionnel dans miR de exogène introduite. Fait important, l'application de ce vecteur à base de MNP assure aimantation cellulaire, offrant des possibilités de ciblage magnétique et le suivi IRM non-invasive. Cela peut servir de base à guidés magnétiquement, de la thérapeutique de cellules génétiquement modifiées qui peuvent être contrôlés de façon non invasive avec l'IRM.
Thérapie génique et cellulaire sont des outils puissants qui ont le potentiel pour résoudre les défis actuels dans le traitement CVD. Malgré le fait que ces deux approches sont actuellement testées dans les essais cliniques, ils ne sont pas encore prêts pour l' application clinique large 1. En particulier, une approche commune pour faire face aux défis de la thérapie génique et cellulaire est de développer des vecteurs de transfert de gènes multifonctionnels appropriés pour l'application clinique. L'absence de systèmes d'administration de gènes sûrs et efficaces est la principale préoccupation de la thérapie génique. En même temps, le génie génétique des produits cellulaires avant la transplantation pourrait surmonter les graves défis de la thérapie cellulaire, tels que la faible efficacité (par exemple, dans le domaine cardiaque, seulement ~ 5% d'amélioration fonctionnelle est réalisée une transplantation de cellules post-tige 1 ) et une mauvaise rétention / au greffe site de la lésion (c. -à- rétention cellulaire tombe en dessous de 5 – 10% en quelques minutes à quelques heures post application, quelle que soit la voie d'administration 2, 3, 4).
À ce jour, les vecteurs viraux dépassent largement les systèmes non viraux en termes d'efficacité, ce qui a donné lieu à une plus large application dans les essais cliniques (~ 67%) 5. Toutefois, les véhicules viraux comportent des risques graves, telles que l' immunogénicité (et la réponse inflammatoire subséquente, avec des complications graves), l' oncogénicité et les limites de la taille du matériel génétique porté 6. En raison de ces problèmes de sécurité et les coûts élevés de production de vecteurs viraux, l'utilisation de systèmes non viraux est préférable dans certains cas , 7, 8. Il est particulièrement adapté pour des troubles qui nécessitent une correction génétique transitoire, tels que l'expression de facteurs de croissance qui contrôlent l' angiogenèse (par exemple, pour le traitement CVD) ou la delivery des vaccins.
Dans notre groupe, un système de délivrance a été conçue en combinant ramifié de 25 kDa de la polyéthylèneimine (PEI) et de nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (MNP) liés ensemble par une interaction biotine-streptavidine 9. Ce vecteur est un outil potentiel pour le génie génétique des cellules, ce qui permet de leur aimantation simultanée avant la transplantation. Ce dernier constitue une base pour le guidage magnétique / rétention, ce qui est particulièrement prometteuse de nos jours, comme les techniques de ciblage magnétique avancées sont en cours d' élaboration avec succès 10. En outre, les cellules résultantes magnétiquement sensibles sont susceptibles d'être contrôlés de manière non invasive par imagerie par résonance magnétique (IRM) ou l' imagerie de particules magnétiques 11, 12.
Dans le cas du vecteur PEI / MNP, polyamine assure la condensation de l'acide nucléique et ainsi la protection de facteur dégradant s, intériorisation de vecteur dans les cellules, et endosomes échapper 5. Les MNP complètent les propriétés de PEI, non seulement en termes de guidage magnétique, mais aussi en réduisant la toxicité connue PEI 7, 13, 14. Auparavant, les propriétés vectorielles PEI / MNP ont été ajustés en termes d'efficacité d'administration ( à savoir, ADNp et miARN) et de la sécurité en utilisant des fibroblastes et des cellules souches mésenchymateuses humaines 15, 16.
Dans ce manuscrit, un protocole détaillé sur l'application de PEI / MNP pour la génération de cellules modifiées miRNA-17 est décrite. A cet effet, les HUVEC sont utilisés et représentent un modèle établi pour l' angiogenèse in vitro. Ils sont difficiles à transfecter et sont sensibles à l' influence toxique 18, 19,ass = "xref"> 20. De plus, nous fournissons un algorithme pour évaluer ces cellules in vitro, y compris leur ciblage, la communication intercellulaire, et la détection IRM.
La production de cellules génétiquement modifiées chargées de nanoparticules superparamagnétiques pour leur orientations supplémentaires à commande magnétique est présentée dans le protocole actuel. L'application réussie de cette stratégie permet la résolution de certaines difficultés de la thérapie cellulaire, comme une faible rétention et pauvres dans la région prise de greffe blessés 2, 3, 4, en fournis…
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier G. Fulda (Electron Microscopy Center, Université de Rostock, Allemagne) pour le soutien technique à l'acquisition d'images TEM de nanoparticules superparamagnétiques filtrées et à effectuer leur analyse aux rayons X. Les travaux effectués au RTC Rostock a été soutenu par le Ministère fédéral de l'éducation et de la recherche en Allemagne (FKZ 0312138A, FKZ 316159 et VIP + 03VP00241) et l'État Mecklembourg-Poméranie occidentale avec les Fonds structurels de l'UE (FSE / IV-WM-B34- 0030/10 et FSE / IV-BM-B35-0010 / 12) et par le DFG (DA 1296-1), le Damp-Foundation, et la base de coeur allemand (F / 01/12). Frank Wiekhorst a été soutenu par le programme de recherche de l'UE 7e PC "Nanomag" FP7-NMP-2013-GRAND-7.
PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45µm |
Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120KV | |
Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
Cell culture plastic | TPP | ||
NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
Pre-miR miRNA Precursor Molecules – Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
BSA | Sigma Aldrich | ||
MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
MPS device | Bruker Biospin | ||
Matlab software | Mathworks | ||
Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~1.3T, coercivity ≥ 955 kA/m |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |