Рекомбинантная экспрессия белков, кристаллизация и биофизические исследования<em> Bacillus</em> -содержащая нуклеотидная пирофосфорилаза, BcMazG
Summary
Bacillus anthracis является облигатным возбудителем фатальной ингаляционной сибирской язвы, поэтому исследования его генов и белков строго регламентированы. Альтернативный подход – изучение ортологичных генов. Мы описываем биофизико-химические исследования ортолога B. anthracis в B. cereus , bc1531, требующие минимального экспериментального оборудования и не имеющих серьезных проблем с безопасностью.
Abstract
Чтобы преодолеть ограничения безопасности и правила при изучении генов и белков от истинных патогенов, их гомологи могут быть изучены. Bacillus anthracis является облигатным возбудителем, вызывающим смертельную ингаляционную сибирскую язву. Bacillus cereus считается полезной моделью для изучения B. anthracis из-за ее тесной эволюционной взаимосвязи. Ген кластера ba1554 – ba1558 B. anthracis высококонсервативен с кластером bc1531 – bc1535 у B. cereus , а также с bt1364 – bt1368 кластером в Bacillus thuringiensis, что указывает на критическую роль ассоциированных генов в роде Bacillus . В этой рукописи описаны методы получения и характеристики белкового продукта первого гена ( ba1554 ) из кластера генов B. anthracis с использованием рекомбинантного белка его ортолога в B. cereus , bc1531.
Introduction
Рекомбинантная экспрессия белка широко используется для преодоления проблем, связанных с природными источниками белка, таких как ограниченное количество белка и вредное загрязнение. Более того, в исследованиях патогенных генов и белков может быть использован альтернативный лабораторный штамм, который не требует дополнительных мер предосторожности. Например, Bacillus cereus является полезной моделью для изучения Bacillus anthracis из-за их тесной эволюционной связи 1 .
B. anthracis является облигатным возбудителем , который вызывает смертельную ингаляционную сибирскую язву у людей и животных и может потенциально использоваться в качестве биологического оружия 2 . Таким образом, лабораторные исследования B. anthracis строго регулируются Центрами США по контролю за заболеваниями, требующими практики биобезопасности 3 (BSL-3), в соответствии с которой лабораторная зона должна быть изолирована с отрицательным давлением в помещении. В отличие от B. anthracis </eM>, B. cereus классифицируется как агент BSL-1 и, следовательно, имеет минимальные проблемы безопасности. B. cereus – это оппортунистический патоген, который после заражения вызывает пищевое отравление, которое можно лечить без медицинской помощи. Однако, поскольку B. cereus разделяет многие критические гены с B. anthracis , функции белков B. anthracis могут быть изучены с использованием соответствующих гомологов B. cereus 1 .
Ген кластера ba1554 – ba1558 B. anthracis высококонсервативен с использованием кластера bc1531 – bc1535 B. cereus , а также с bt1364-bt1368 кластером Bacillus thuringiensis , с точки зрения организации и последовательности гена. Кроме того, первые гены ( ba1554 , bc1531 и bt1364 ) соответствующих кластеров абсолютно сохраняются ( т.е. идентичность 100% нуклеотидной последовательности), impliНг критической роли генный продукт в Bacillus видов. Из-за его расположения в этих кластерах генов ba1554 был ошибочно идентифицирован как предполагаемый регулятор транскрипции 3 . Однако анализ аминокислотной последовательности продукта ba1554 показывает, что он относится к семейству MazG, которое обладает нуклеотидной пирофосфогидролазной активностью и не связано с активностью транскрипционных факторов 4 , 5 . Хотя белки, принадлежащие к семейству MazG, разнообразны по отношению к общей последовательности и длине, они имеют общий ~ 100 остаточный домен MazG, характеризующийся мотивом EXXE 12-28 EXXD («X» обозначает любой аминокислотный остаток, а число Указывает количество X остатков).
Домен MazG не всегда непосредственно учитывает определенную каталитическую активность. Член MazG от Escherichia coli (EcMazG) обладает двумя доменами MazG, но наС-концевой домен MazG является ферментативно активным 6 . Более того, субстратная специфичность ферментов MazG варьирует от неспецифических нуклеозидтрифосфатов (для EcMazG) до специфических dCTP / dATP (для интегрина-ассоциированного MazG) и dUTP (для dUTPases) 6 , 7 , 8 , 9 . Таким образом, биофизикохимические анализы белка BA1554 необходимы для подтверждения его активности NTP-азы и для расшифровки его субстратной специфичности.
Здесь мы приводим поэтапный протокол, согласно которому большинство лабораторий без BSL-3 могут следовать, чтобы охарактеризовать белковый продукт гена B.cereus bc1531 , который является ортологом B. anthracis ba1554 на молекулярном уровне. Вкратце, рекомбинантный BC1531 (rBC1531) экспрессировали в E.coli и очищали с использованием метки аффинности. Для рентгеновских кристаллографических экспериментов кристаллыУсловия белка rBC1531 были скринированы и оптимизированы. Для оценки ферментативной активности rBC1531 активность NTPазы контролировали колориметрически, чтобы избежать радиоактивно меченых нуклеотидов, которые традиционно использовались. Наконец, анализ полученных биофизикохимических данных позволил нам определить состояние олигомеризации и каталитические параметры rBC1531, а также получить данные рентгеноструктурного анализа кристалла rBC1531.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Рентгеновские дифракционные наборы были собраны на пучковой линии 7А Лаборатории ускорителей Пхохан (Корея). Это исследование было поддержано Программой фундаментальных исследований, проводимой Национальным научно-исследовательским фондом Кореи (NRF), финансируемой Министерством науки, ИКТ и перспективного планирования (2015R1A1A01057574 МЗ).
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
Referências
- Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
- Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
- Deli, A., et al. LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis. FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).
- Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. MazG — a regulator of programmed cell death in Escherichia coli. Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).
- Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. House cleaning, a part of good housekeeping. Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).
- Lee, S., et al. Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response. J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).
- Moroz, O. V., et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential "house-cleaning" functions. J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).
- Robinson, A., et al. A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype. Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).
- Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, (2012).
- Brown, T. A. . Gene cloning an introduction. , (1986).
- Kim, M. I., Hong, M. Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase. Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).
- Sheehan, D. . Physical biochemistry: Principles and applications. , (2009).
- Lesley, S. A., Wilson, I. A. Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics. J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).
- Jeon, Y. J., et al. Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase. J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).
