إعداد وتوصيف رواية هدل-محاكاة الجسيمات النانوية لتغليف عامل النمو العصبي
Summary
تم استخدام التجانس بسيطة لإعداد رواية، عالية الكثافة، البروتينات الدهنية تحاكي الجسيمات النانوية لتغليف عامل نمو الأعصاب. يتم وصف التحديات، والبروتوكولات التفصيلية لإعداد جسيمات متناهية الصغر، توصيف في المختبر ، والدراسات في الجسم الحي في هذه المقالة.
Abstract
والهدف من هذه المادة هو تقديم أساليب إعداد وتوصيف لعامل نمو الأعصاب (نغف)، تحميل، عالية الكثافة، البروتين الدهني (هدل) – محاكاة الجسيمات النانوية (نبس). إن هدل هي نپس الذاتية وقد تم استكشافها كمركبات لتسليم العوامل العلاجية. وقد تم تطوير أساليب مختلفة لإعداد هدل-محاكيات نيبس. ومع ذلك، فهي معقدة عموما، وتستغرق وقتا طويلا، وصعبة على نطاق صناعي المتابعة. في هذه الدراسة، تم استخدام التجانس من خطوة واحدة لخلط سواغ وتشكيل نبس النموذج. نغف هو بروتين قابل للذوبان في الماء من 26 كيلو دالتون. لتسهيل تغليف نغف في البيئة الدهنية من هدل-محاكي نبس، تم استخدام بروتامين أوسب لتشكيل مجمع الأيونات الزوج مع نغف لتحييد الرسوم على سطح نغف. ثم تم إدخال مجمع نغف / بروتامين في النماذج الأولية. أبوليبوبروتين أي المغلفة أخيرا على سطح نبس. أظهرت نغف هدل-ميمكينغ نبيس خصائص مفضلة في المدىs من حجم الجسيمات، توزيع الحجم، كفاءة التخميد، في المختبر الافراج، النشاط الحيوي، و بيوديستريبوتيون. مع تصميم دقيق واستكشاف التجانس في هدل-محاكاة نيب، تم تبسيط الإجراء إلى حد كبير، وجعلت نبس قابلة للتطوير. وعلاوة على ذلك، تم التغلب على التحديات المختلفة، مثل فصل نغف تفريغها من نبس، وإجراء دراسات موثوقة في المختبر الإفراج، وقياس النشاط الحيوي لل نبس.
Introduction
جزيئات كبيرة، مثل البروتينات، والببتيدات، والأحماض النووية، وقد ظهرت كدواء واعدة واكتسبت اهتماما كبيرا في العقود الماضية 1 ، 2 . نظرا لفعاليتها عالية وطرق عمل محددة، فإنها تظهر إمكانات علاجية كبيرة لعلاج السرطان، والأمراض المناعية، وفيروس نقص المناعة البشرية، والظروف ذات الصلة 3 ، 4 . ومع ذلك، فإن الخصائص الفيزيوكيميائية، مثل حجمها الجزيئي الكبير، هيكل ثلاثي الأبعاد، ورسوم السطح، وطبيعة ماء، وجعل في تسليم الجسم الحي من هذه الجزيئات صعبة للغاية. هذا يعوق بشكل كبير استخدامها السريري 4 . التطورات الأخيرة في أنظمة تسليم المخدرات، مثل الجسيمات الدقيقة، الجسيمات النانوية البوليمر (نبس)، الجسيمات الشحمية، و نبس الدهون، تغلبت هذه التحديات وتحسين كبير في تسليم الجسم الحي من الجزيئات. هووقد تم الكشف عن بعض العيوب فيما يتعلق بشحنات التسليم هذه، بما في ذلك انخفاض قدرة تحميل الدواء، وانخفاض كفاءة الانحباس، ونصف العمر القصير، وفقدان النشاط الحيوي، والآثار الجانبية غير المرغوبة 5 و 6 و 7 و 8 . ولا تزال نظم الموجات الحاملة الفعالة مجالا للاهتمام البحثي. وعلاوة على ذلك، فإن تطوير أساليب تحليلية لتوصيف نبس محملة المخدرات هو أكثر تحديا للجزيئات الصغيرة من الجزيئات الصغيرة.
البروتين الدهني عالي الكثافة (هدل) هو نب الطبيعية تتكون من جوهر الدهون التي هي المغلفة من أبوليبوبروتينز وأحادي الطبقة الفوسفاتية. يلعب هدل الذاتية دورا حاسما في نقل الدهون والبروتينات والأحماض النووية من خلال تفاعلها مع المستقبلات المستهدفة مثل سر-بي و أبكاي و ABCG1. وقد تم استكشافه كوسيلة لتسليم مختلف العوامل العلاجية 9، 10 ، 11 ، 12 . وقد تم تطوير أساليب مختلفة لإعداد هدل-محاكيات نيبس. غسيل الكلى هو نهج شعبية. في هذه الطريقة، يتم تشكيل نبس عن طريق ترطيب فيلم الدهون باستخدام حل الصوديوم الصوديوم. ثم يتم إزالة الملح من خلال غسيل الكلى لمدة يومين مع ثلاثة مخازن 13 . طرق سونيكاتيون تلفيق نبس عن طريق سونيكاتينغ خليط الدهون لمدة 60 دقيقة تحت حالة التدفئة. يتم تنقية نبس أكثر من خلال اللوني هلام 14 . ميكروفليديكش يولد نبس عن طريق جهاز ميكروفلويديك، الذي يمزج الفوسفورية و أبوليبوبروتين أي (أبو أي) الحلول من خلال خلق ميكروفورتيسز في نمط التركيز 15 . ومن الواضح أن هذه الأساليب يمكن أن تكون مضيعة للوقت وقاسية وصعبة على النطاق الصناعي.
في هذه المقالة، ونحن نقدم إعداد وتوصيف رواية هدل-محاكاة نيب للأعصابعامل النمو (نغف). نغف هو مثبط ثنائي ببتيد هوموديمر تحتوي على اثنين من 13.6 كيلو دالتون ببتيد أحادية. وقد تم تطوير إجراء جديد لإعداد نبس عن طريق التجانس، تليها تغليف نغف في نبس. وقد تميزت نغف هدل-محاكاة نيبس لحجم الجسيمات، وتوزيع الحجم، وإمكانات زيتا، والإفراج في المختبر . تم تقييم نشاطها الحيوي لانتشار نيوريت في خلايا PC12. تمت مقارنة بيوديستريبوتيون من نغف هدل-محاكاة نيبس مع أن من نغف مجانا بعد الحقن في الوريد في الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن نبرهن على طريقة بسيطة لإعداد هدل-محاكاة نيبس للتغليف نغف. وقد تم دراسة مختلف أنظمة التسليم نب لتقديم البروتينات. حاليا، العديد من الاستعدادات نب تشمل غسيل الكلى، وهطول المذيبات، وترطيب الفيلم. وهذه العمليات معقدة عموما وتحديا عند توسيع نطاقها. خ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R03 NS087322-01 إلى دونغ، X.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
Referências
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
- Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
- Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. Long-term delivery of protein therapeutics. Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).
- Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. . Medical application of liposomes. , (1998).
- Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
- Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
- Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
- Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature’s multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
- Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
- McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
- McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
- Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
- Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
- Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
- Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).
