Enkel homogenisering användes för att framställa nya, högdensitets-, lipoproteinmimickande nanopartiklar för att inkapsla nervtillväxtfaktorn. Utmaningar, detaljerade protokoll för beredning av nanopartiklar, in vitro- karaktärisering och in vivo- studier beskrivs i denna artikel.
Syftet med denna artikel är att introducera berednings- och karaktäriseringsmetoder för nervtillväxtfaktor (NGF) -belastade, högdensitets-, lipoprotein (HDL) -imiterande nanopartiklar (NP). HDL är endogena NP och har undersökts som vehiklar för leverans av terapeutiska medel. Olika metoder har utvecklats för att framställa HDL-imitativa NP. Men de är i allmänhet komplicerade, tidskrävande och svåra för industriell uppskalning. I denna studie användes en-stegs homogenisering för att blanda hjälpämnena och bilda prototypen NP. NGF är ett vattenlösligt protein av 26 kDa. För att underlätta inkapslingen av NGF i lipidmiljön för HDL-imiterande NP användes protamin USP för att bilda ett jonparkomplex med NGF för att neutralisera laddningarna på NGF-ytan. NGF / protaminkomplexet infördes därefter i prototypen NP. Apolipoprotein AI belades slutligen på ytan av NP. NGF HDL-imiterande NP visade föredragna egenskaper i termenS med partikelstorlek, storleksfördelning, infångningsverkningsgrad, in vitro- frisättning, bioaktivitet och biodistribution. Med noggrann utformning och undersökning av homogenisering i HDL-imitativa NP, förenklades proceduren väsentligt och NP: erna blev skalbara. Dessutom övervanns olika utmaningar, såsom att skilja lossat NGF från NP, genomföra tillförlitliga in vitro- frisättningsstudier och mäta bioaktiviteten hos NP: erna.
Makromolekyler, såsom proteiner, peptider och nukleinsyror, har kommit fram som lovande läkemedel och har fått stor uppmärksamhet under de senaste decennierna 1 , 2 . På grund av deras effektiva och specifika åtgärdslägen uppvisar de stor terapeutisk potential för behandling av cancer, immunsjukdomar, hiv och relaterade tillstånd 3 , 4 . Emellertid gör fysiokemiska egenskaper, såsom deras stora molekylstorlek, tredimensionell struktur, ytladdningar och hydrofil natur, in vivo- avgivning av dessa makromolekyler mycket utmanande. Detta försvårar avsevärt deras kliniska användning 4 . Nya framsteg inom läkemedelsleveranssystem, såsom mikropartiklar, polymer nanopartiklar (NP), liposomer och lipid-NP, överträffade dessa utmaningar och förbättrade signifikant in vivo- leveransen av makromolekyler. HoWever har vissa nackdelar beträffande dessa leveransladdningar visat sig, inklusive låg läkemedelslastkapacitet, låg infångningseffektivitet, kort halveringstid, förlust av bioaktivitet och oönskade biverkningar 5 , 6 , 7 , 8 . Effektiva bärsystem är fortfarande ett forskningsområde. Vidare är utvecklingen av analysmetoder för att karakterisera läkemedelsbelastade NP mer utmanande för makromolekyler än för små molekyler.
High-density lipoprotein (HDL) är en naturlig NP bestående av en lipidkärna som är belagd av apolipoproteiner och ett fosfolipidmonolager. Endogen HDL spelar en kritisk roll i transporten av lipider, proteiner och nukleinsyror genom dess interaktion med målreceptorer, såsom SR-BI, ABCAI och ABCG1. Det har undersökts som ett medel för leverans av olika terapeutiska medel 9, 10 , 11 , 12 . Olika metoder har utvecklats för att framställa HDL-imitativa NP. Dialys är ett populärt tillvägagångssätt. I denna metod bildas NP genom hydratisering av en lipidfilm med användning av natriumkolatlösning. Saltet avlägsnas sedan genom en 2-dagsdialys med tre buffertar 13 . Sonikationsmetoder tillverkar NP genom att sonikera en lipidblandning under 60 minuter under ett uppvärmningsförhållande; NP: erna renas vidare genom gelkromatografi 14 . Mikrofluidika genererar NP via en mikrofluidisk enhet som blandar fosfolipider och apolipoprotein AI (Apo AI) lösningar genom att skapa mikrovortor i ett fokuseringsmönster 15 . Tydligen kan dessa metoder vara tidskrävande, hårda och svåra för industriell uppskalning.
I denna artikel introducerar vi förberedelser och karakterisering av nya HDL-imitativa NP för nervTillväxtfaktor (NGF) inkapsling. NGF är en disulfidbunden polypeptidhomodimer innehållande två 13,6-kDa polypeptidmonomerer. Ett nytt förfarande för framställning av NP genom homogenisering, följt av inkapslingen av NGF i NP, utvecklades. De NGF HDL-imiterande NP: erna karakteriserades för partikelstorlek, storleksfördelning, zeta potential och in vitro- frisättning. Deras bioaktivitet utvärderades för neuritutväxt i PC12-celler. Biodistributionen av NGF HDL-imiterande NPs jämfördes med den för fri NGF efter intravenös injektion i möss.
I denna studie visar vi en enkel metod för att förbereda HDL-imitativa NP för NGF-inkapsling. Olika NP-leveranssystem har studerats för att leverera proteiner. För närvarande innefattar många NP-preparat dialys, lösningsmedelsutfällning och filmhydratisering. Dessa processer är i allmänhet komplicerade och utmanande vid uppskalning. Under denna NP-utveckling bestämdes att lipiderna hade stark vidhäftning till behållarens glasvägg, vilket ledde till svårigheterna att hydratisera den tunna filmen och effek…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH R03 NS087322-01 till Dong, X.
Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |