Vorbereitung und Charakterisierung von neuartigen HDL-imitierenden Nanopartikeln für die Nervenwachstumsfaktorverkapselung
Summary
Eine einfache Homogenisierung wurde verwendet, um neuartige, hochdichte, lipoproteinimimierende Nanopartikel herzustellen, um den Nervenwachstumsfaktor einzukapseln. Herausforderungen, detaillierte Protokolle für die Nanopartikelpräparation, in vitro Charakterisierung und in vivo Studien sind in diesem Artikel beschrieben.
Abstract
Das Ziel dieses Artikels ist es, Präparations- und Charakterisierungsmethoden für Nervenwachstumsfaktor (NGF) -belastete, hochdichte, lipoprotein (HDL) -Mimiking-Nanopartikel (NPs) einzuführen. HDLs sind endogene NPs und wurden als Vehikel für die Lieferung von therapeutischen Mitteln untersucht. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um HDL-mimicking NPs vorzubereiten. Allerdings sind sie in der Regel kompliziert, zeitaufwendig und schwierig für die industrielle Scale-up. In dieser Studie wurde eine einstufige Homogenisierung verwendet, um die Hilfsstoffe zu mischen und die Prototyp-NPs zu bilden. NGF ist ein wasserlösliches Protein von 26 kDa. Um die Verkapselung von NGF in die Lipidumgebung von HDL-imitierenden NPs zu erleichtern, wurde Protamin USP verwendet, um einen Ionenpaarkomplex mit NGF zu bilden, um die Ladungen auf der NGF-Oberfläche zu neutralisieren. Der NGF / Protamin-Komplex wurde dann in die Prototyp-NPs eingeführt. Apolipoprotein AI wurde schließlich auf die Oberfläche der NPs aufgetragen. NGF HDL-imitieren NPs zeigten bevorzugte Eigenschaften im BegriffS Partikelgröße, Größenverteilung, Einfangwirkung, In-vitro- Freisetzung, Bioaktivität und Biodistribution. Mit dem sorgfältigen Design und der Erforschung der Homogenisierung in HDL-imitierenden NPs wurde das Verfahren stark vereinfacht und die NPs wurden skalierbar gemacht. Darüber hinaus wurden verschiedene Herausforderungen wie die Trennung von unbelastetem NGF von den NPs, die Durchführung zuverlässiger in vitro- Freisetzungsuntersuchungen und die Messung der Bioaktivität der NPs überwunden.
Introduction
Makromoleküle wie Proteine, Peptide und Nukleinsäuren sind als vielversprechende Medikamente aufgetaucht und haben in den vergangenen Jahrzehnten erhebliche Aufmerksamkeit erlangt 1 , 2 . Aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit und spezifischen Wirkungsweisen zeigen sie ein großes therapeutisches Potenzial für die Behandlung von Krebs, Immunerkrankungen, HIV und verwandten Bedingungen 3 , 4 . Jedoch machen physiochemische Eigenschaften, wie ihre große molekulare Größe, dreidimensionale Struktur, Oberflächenladungen und hydrophile Natur, die in vivo- Abgabe dieser Makromoleküle sehr anspruchsvoll. Dies beeinträchtigt ihre klinische Anwendung erheblich 4 . Jüngste Fortschritte in Arzneimittelabgabesystemen wie Mikropartikeln, Polymer-Nanopartikeln, Nerven, Liposomen und Lipid-NPs, überwand diese Herausforderungen und verbesserte die in vivo- Zufuhr von Makromolekülen erheblich. HoWeil, einige Nachteile in Bezug auf diese Liefergüter wurden aufgedeckt, einschließlich niedrige Drogenbelastung Kapazität, niedrige Einschluss Effizienz, kurze Halbwertszeit, Verlust der Bioaktivität und unerwünschte Nebenwirkungen 5 , 6 , 7 , 8 . Effektive Trägersysteme bleiben ein Forschungsgebiet. Darüber hinaus ist die Entwicklung von analytischen Methoden zur Charakterisierung von Arzneimittel-geladenen NPs für Makromoleküle schwieriger als für kleine Moleküle.
High-Density-Lipoprotein (HDL) ist ein natürlicher NP, der aus einem Lipidkern besteht, der mit Apolipoproteinen und einer Phospholipidmonoschicht beschichtet ist. Endogene HDL spielt eine wichtige Rolle beim Transport von Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren durch ihre Wechselwirkung mit Zielrezeptoren wie SR-BI, ABCAI und ABCG1. Es wurde als Vehikel für die Lieferung von verschiedenen therapeutischen Mitteln untersucht 9, 10 , 11 , 12 . Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um HDL-mimicking NPs vorzubereiten. Dialyse ist ein beliebter Ansatz. Bei diesem Verfahren werden NPs durch Hydratisierung eines Lipidfilms unter Verwendung von Natriumcholatlösung gebildet. Das Salz wird dann durch eine 2-tägige Dialyse mit drei Puffern 13 entfernt . Sonessionsverfahren herstellen NPs durch Beschallung einer Lipidmischung für 60 min unter einer Heizbedingung; Die NPs werden durch Gelchromatographie weiter gereinigt. Mikrofluidik erzeugt NPs über eine mikrofluidische Vorrichtung, die Phospholipide und Apolipoprotein AI (Apo AI) Lösungen durch die Herstellung von Mikrovortices in einem Fokussierungsmuster 15 vermischt. Klar, diese Methoden können zeitraubend, hart und schwierig für industrielle Scale-up.
In diesem Artikel stellen wir die Vorbereitung und Charakterisierung von neuartigen HDL-mimicking NPs für Nerven vorWachstumsfaktor (NGF) Verkapselung. NGF ist ein Disulfid-verknüpftes Polypeptid-Homodimer, das zwei 13,6-kDa-Polypeptidmonomere enthält. Ein neuartiges Verfahren zur Herstellung der NPs durch Homogenisierung, gefolgt von der Verkapselung von NGF in die NPs, wurde entwickelt. Die NGF-HDL-imitierenden NPs wurden für Partikelgröße, Größenverteilung, Zetapotential und in vitro Freisetzung charakterisiert. Ihre Bioaktivität wurde für das Neuritenwachstum in PC12-Zellen untersucht. Die Biodistribution von NGF-HDL-imitierenden NPs wurde mit der von freiem NGF nach intravenöser Injektion bei Mäusen verglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie zeigen wir eine einfache Methode zur Vorbereitung von HDL-Mimik-NPs für die NGF-Kapselung. Verschiedene NP-Abgabesysteme wurden untersucht, um Proteine zu liefern. Derzeit umfassen viele NP-Präparate Dialyse, Lösungsmittelabscheidung und Filmhydratation. Diese Prozesse sind im Allgemeinen kompliziert und anspruchsvoll beim Scale-up. Während dieser NP-Entwicklung wurde festgestellt, dass die Lipide eine starke Haftung an der Glaswand des Behälters hatten, was zu den Schwierigkeiten bei der Hyd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIH R03 NS087322-01 an Dong, X.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
Referências
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