Utilizou-se homogeneização simples para preparar novas nanopartículas imitando lipoproteínas de alta densidade para encapsular o factor de crescimento nervoso. Desafios, protocolos detalhados para a preparação de nanopartículas, caracterização in vitro e estudos in vivo são descritos neste artigo.
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Artigo de método
Preparação e caracterização de novas nanopartículas simuladoras de HDL para encapsulação de fatores de crescimento nervoso
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo deste artigo é introduzir métodos de preparação e caracterização de nanopartículas (NPs) de nanopartículas de alta densidade, lipoproteínas (NPs) carregadas com fator de crescimento nervoso (NGF). As HDLs são NPs endógenas e foram exploradas como veículos para a administração de agentes terapêuticos. Vários métodos foram desenvolvidos para preparar NPs que imitam o HDL. No entanto, eles são geralmente complicados, demorados e difíceis para a escala industrial up. Neste estudo, a homogeneização em uma etapa foi utilizada para misturar os excipientes e formar o protótipo NPs. O NGF é uma proteína solúvel em água de 26 kDa. Para facilitar a encapsulação de NGF no ambiente lipídico de NPs que imitam HDL, utilizou-se protamina USP para formar um complexo de pares de iões com NGF para neutralizar as cargas na superfície de NGF. O NGF / complexo de protamina foi então introduzido no protótipo NPs. A apolipoproteína AI foi finalmente revestida na superfície dos NPs. NGF HDL imitando NPs mostraram propriedades preferíveis em termosS de tamanho de partícula, distribuição de tamanho, eficiência de aprisionamento, liberação in vitro , bioatividade e biodistribuição. Com o cuidadoso desenho e exploração da homogeneização em NPs que imitam HDL, o procedimento foi grandemente simplificado e as NPs foram feitas escalonáveis. Além disso, foram superados vários desafios, como separar o NGF não carregado dos NPs, realizar estudos confiáveis de liberação in vitro e medir a bioatividade dos NPs.
Introdução
As macromoléculas, como proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos, têm emergido como medicamentos promissores e ganharam considerável atenção nas últimas décadas 1 , 2 . Devido à sua alta eficácia e modos de ação específicos, eles apresentam grande potencial terapêutico para os tratamentos de câncer, doenças imunes, HIV, e condições relacionadas 3 , 4 . No entanto, as propriedades físico-químicas, tais como o seu grande tamanho molecular, estrutura tridimensional, cargas de superfície e natureza hidrofílica, tornam a introdução in vivo destas m....
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Protocolo
NOTA: Os estudos em animais incluídos em todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte de Texas.
1. Preparação de nanopartículas NGF HDL-imitando
- Dissolver os excipientes, fosfatidilcolina (PC), esfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), oleato de colesterilo (CO) e succinato de D-α-tocoferil polietilenoglicol (TPGS), em etanol para preparar soluções-mãe a 1 mg / mL.
NOTA: As soluções stock foram aliquotadas e armazenadas a -20 ° C. O oleato de colesterilo foi armazenado em garrafas escuras. As soluções mãe PC, SM, PS e CO foram estáveis ....
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Resultados
O esquema de engenharia de NGF NPs revestidos com α-tocoferol, imitando o HDL, preparado por uma estratégia de pares de iões é mostrado na Figura 1 . Para neutralizar as cargas superficiais de NGF, utilizou-se a protamina USP como um agente de pares de iões para formar um complexo com NGF. Para proteger a bioatividade, os protótipos de NPs simuladores de HDL foram projetados, primeiro usando homogeneização; Depois, o complexo NGF / protamina foi encapsulado no protótipo .......
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Discussão
Neste estudo, demonstramos um método simples para preparar NPs que imitam o HDL para o encapsulamento de NGF. Vários sistemas de libertação de NP foram estudados para fornecer proteínas. Atualmente, muitas preparações de NP envolvem diálise, precipitação com solvente e hidratação de filme. Esses processos são geralmente complicados e desafiadores na escala-up. Durante este desenvolvimento de NP, determinou-se que os lípidos tinham uma forte aderência à parede de vidro do recipiente, o que levou às dificuldades em hidrat.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi suportado por NIH R03 NS087322-01 a Dong, X.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Beta-NGF humano recombinante | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-&alfa;-fosfatidilcolina (PC) | Avanti | 131601P | 95%, ovo, |
| esfingomielina de frango (SM) | Avanti | 860062P | cérebro, |
| fosfatidilserina suína (PS) | Avanti | 840032P | cérebro, |
| oleato de colesterol suíno (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-&alfa;-Tocoferol succinato de polietilenoglicol (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamina E Polietilenoglicol Succinato Sulfato |
| Protamina | Sigma | P3369 | atende às especificações de teste da USP |
| Apolipoproteína A1, plasma humano | Athens Research & Tecnologia | 16-16-120101 | 1 mg em 671 µ L 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Agarose reticulada, material de enchimento de coluna de cromatografia de filtração em gel |
| Kit ELISA sanduíche para NGF | R& D sistema | DY008 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 médio | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Soro de cavalo | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Soro bovino fetal | Gibco | 10082147 | |
| PC12 células | ATCC | CRL-1721 | |
| Cauda de rato colágeno tipo I | Sigma | C3867 | |
| Acetato de sódio | Sigma | S2889 | |
| Cloreto de sódio | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Cloreto de benzetônio | Sigma | B8879 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo< | strong>Comentários |
| Equipamento | |||
| Homogeneizador | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dispositivo de Diálise | Spectrum Laboratories | G235036 | Centrífuga de Molécula de Corte 300 kDa |
| Eppendoff | 5424R | ||
| Homogeneizador Polytron | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
Referências
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. ....
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Reimpressões e permissões
