Preparação e caracterização de novas nanopartículas simuladoras de HDL para encapsulação de fatores de crescimento nervoso

Summary

Utilizou-se homogeneização simples para preparar novas nanopartículas imitando lipoproteínas de alta densidade para encapsular o factor de crescimento nervoso. Desafios, protocolos detalhados para a preparação de nanopartículas, caracterização in vitro e estudos in vivo são descritos neste artigo.

Abstract

O objetivo deste artigo é introduzir métodos de preparação e caracterização de nanopartículas (NPs) de nanopartículas de alta densidade, lipoproteínas (NPs) carregadas com fator de crescimento nervoso (NGF). As HDLs são NPs endógenas e foram exploradas como veículos para a administração de agentes terapêuticos. Vários métodos foram desenvolvidos para preparar NPs que imitam o HDL. No entanto, eles são geralmente complicados, demorados e difíceis para a escala industrial up. Neste estudo, a homogeneização em uma etapa foi utilizada para misturar os excipientes e formar o protótipo NPs. O NGF é uma proteína solúvel em água de 26 kDa. Para facilitar a encapsulação de NGF no ambiente lipídico de NPs que imitam HDL, utilizou-se protamina USP para formar um complexo de pares de iões com NGF para neutralizar as cargas na superfície de NGF. O NGF / complexo de protamina foi então introduzido no protótipo NPs. A apolipoproteína AI foi finalmente revestida na superfície dos NPs. NGF HDL imitando NPs mostraram propriedades preferíveis em termosS de tamanho de partícula, distribuição de tamanho, eficiência de aprisionamento, liberação in vitro , bioatividade e biodistribuição. Com o cuidadoso desenho e exploração da homogeneização em NPs que imitam HDL, o procedimento foi grandemente simplificado e as NPs foram feitas escalonáveis. Além disso, foram superados vários desafios, como separar o NGF não carregado dos NPs, realizar estudos confiáveis ​​de liberação in vitro e medir a bioatividade dos NPs.

Introduction

As macromoléculas, como proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos, têm emergido como medicamentos promissores e ganharam considerável atenção nas últimas décadas ^{1 , 2} . Devido à sua alta eficácia e modos de ação específicos, eles apresentam grande potencial terapêutico para os tratamentos de câncer, doenças imunes, HIV, e condições relacionadas ^{3 , 4} . No entanto, as propriedades físico-químicas, tais como o seu grande tamanho molecular, estrutura tridimensional, cargas de superfície e natureza hidrofílica, tornam a introdução in vivo destas m....

Protocol

NOTA: Os estudos em animais incluídos em todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte de Texas.

1. Preparação de nanopartículas NGF HDL-imitando

1. Dissolver os excipientes, fosfatidilcolina (PC), esfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), oleato de colesterilo (CO) e succinato de D-α-tocoferil polietilenoglicol (TPGS), em etanol para preparar soluções-mãe a 1 mg / mL.
   NOTA: As soluções stock foram aliquotadas e armazenadas a -20 ° C. O oleato de colesterilo foi armazenado em garrafas escuras. As soluções mãe PC, SM, PS e CO foram estáveis ....

Results

O esquema de engenharia de NGF NPs revestidos com α-tocoferol, imitando o HDL, preparado por uma estratégia de pares de iões é mostrado na Figura 1 . Para neutralizar as cargas superficiais de NGF, utilizou-se a protamina USP como um agente de pares de iões para formar um complexo com NGF. Para proteger a bioatividade, os protótipos de NPs simuladores de HDL foram projetados, primeiro usando homogeneização; Depois, o complexo NGF / protamina foi encapsulado no protótipo .......

Discussion

Neste estudo, demonstramos um método simples para preparar NPs que imitam o HDL para o encapsulamento de NGF. Vários sistemas de libertação de NP foram estudados para fornecer proteínas. Atualmente, muitas preparações de NP envolvem diálise, precipitação com solvente e hidratação de filme. Esses processos são geralmente complicados e desafiadores na escala-up. Durante este desenvolvimento de NP, determinou-se que os lípidos tinham uma forte aderência à parede de vidro do recipiente, o que levou às dificuldades em hidrat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beta-NGF humano recombinante	Creative Biomart	NGF-05H
L-&alfa;-fosfatidilcolina (PC)	Avanti	131601P	95%, ovo,
esfingomielina de frango (SM)	Avanti	860062P	cérebro,
fosfatidilserina suína (PS)	Avanti	840032P	cérebro,
oleato de colesterol suíno (CO)	Sigma	C9253
D-&alfa;-Tocoferol succinato de polietilenoglicol (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamina E Polietilenoglicol Succinato Sulfato
Protamina	Sigma	P3369	atende às especificações de teste da USP
Apolipoproteína A1, plasma humano	Athens Research & Tecnologia	16-16-120101	1 mg em 671 µ L 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Agarose reticulada,  material de enchimento de coluna de cromatografia de filtração em gel
Kit ELISA sanduíche para NGF	R& D sistema	DY008
Albumina de soro bovino	Sigma	A2153
RPMI-1640 médio	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Soro de cavalo	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Soro bovino fetal	Gibco	10082147
PC12 células	ATCC	CRL-1721
Cauda de rato colágeno tipo I	Sigma	C3867
Acetato de sódio	Sigma	S2889
Cloreto de sódio	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)	Sigma	P7626
Cloreto de benzetônio	Sigma	B8879
Nome	Empresa	Número de catálogo<	strong>Comentários
Equipamento
Homogeneizador	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dispositivo de Diálise	Spectrum Laboratories	G235036	Centrífuga de Molécula de Corte 300 kDa
	Eppendoff	5424R
Homogeneizador Polytron	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200