Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa
Summary
gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.
Abstract
gotículas lipídicas são vitais para a replicação de uma variedade de diferentes agentes patogénicos, mais proeminentemente o vírus da hepatite C (VHC), tal como o local putativo de morfogese do viri. análise do proteoma de gotículas de gordura quantitativo pode ser usado para identificar proteínas que se localizam a ou são deslocadas a partir de gotículas lipídicas em condições, tais como infecções por vírus. Aqui, descrevemos um protocolo que tem sido utilizado com sucesso para caracterizar as alterações no proteoma de gotículas de gordura após a infecção com HCV. Usamos Stable Isótopos Etiquetagem com Aminoácidos em cultura celular (SILAC) e, assim, identificar o proteoma completa de uma população de células com aminoácidos "pesadas" para quantificar as proteínas por espectrometria de massa. Para o isolamento de gotículas de gordura, as duas populações de células (isto é, / "leves" aminoácidos infectados com HCV e / aminoácidos não infectadas de controlo "pesadas") são misturados 1: 1 e lisadas mecanicamente em tampão hipotónico. Após a remoção dos núcleos e de células debris por centrifugação a baixa velocidade, as proteínas associadas a gotícula de lípido são enriquecidos por dois passos de ultracentrifugação subsequentes seguidos de três passos de lavagem em tampão isotónico. A pureza das fracções de gotículas lipídicas é analisada por transferência de western com anticorpos que reconhecem diferentes compartimentos subcelulares. proteínas associadas a gotícula de lípido são então separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida por manchamento de Coomassie. Após digestão tríptica, os péptidos são quantificados por espectrometria de massa de cromatografia de ionização por electrospray-tandem líquido (LC-ESI-MS / MS). Usando este método, identificamos proteínas recrutados para gotículas lipídicas após infecção HCV que possam representar fatores do hospedeiro pró ou anti-virais. O nosso método pode ser aplicado a uma variedade de diferentes células e condições de cultura, tais como a infecção com agentes patogénicos, o stress ambiental, ou tratamento com droga.
Introduction
Gotículas lipídicas são altamente citoplasmáticos (e nucleares) organelos celulares dinâmicas compostas por um núcleo de lípidos neutros (triglicéridos (TG) e éster de colesterol (EC)) fechado por uma monocamada de fosfolípidos com proteínas incorporadas 1. Todos os tipos de células produzem gotículas lipídicas, mas que variam em tamanho, composição lipídica, e decoração proteína. gotículas lipídicas cumprir diversas funções, incluindo a servir como reservatórios de energia e precursores de membrana ou como depósitos de proteínas. Além disso, através da absorção de lípidos, que protegem as células de lipotoxicidade, lípidos de libertação como moléculas de sinalização, e estão envolvidas na degradação da proteína e respostas a stress do retículo endoplasmático (ER) 2. Como tal, uma série de proteínas ligar-se a gotículas de lípidos e regular a sua geração, degradação, tráfego e interacção com outros organelos. Entre elas estão a família de proteínas de ligação perilipin gotícula de lípido bona fide (PLIN1-5)f "> 3.
Lipid gota biogénese provável começa no ER, em que as enzimas ER-residente catalisar a síntese de lípidos neutros que se acumulam no interior da bicamada da membrana, formando uma lente de lípidos neutros, um processo que foi recentemente visualizado bem em levedura 4. Membrana de dobragem e os níveis de ácido e diacilglicerol fosfatídicos elevadas são depois pensado para atrair as proteínas envolvidas na biossíntese de fosfolípido, como a síntese simultânea dos lípidos neutros e dos fosfolípidos do núcleo de blindagem é necessário para a geração de gotículas de gordura 5. Enzimas que albergam domínios transmembranares que residem no ER catalisar este processo. Expansão de grandes gotículas lipídicas requer a actividade de uma classe diferente de enzimas de síntese de lípidos que abrigam uma hélice anfipática e pode, assim, viajam do RE para gotículas lipídicas. A mobilização de lípidos de gotículas lipídicas ocorre através da activação local do triglicéridese diacilglicerol e lipases da lipase de triglicéridos adiposo (ATGL) e sensível a hormonas lipase (HSL) ou por diferentes vias autofágicos, tais como macro e microlipophagy ou autofagia 6 chaperona-mediada. Gotículas lipídicas interagir com outros organelos celulares, tais como as mitocôndrias (para beta-oxidação e a síntese de lípidos) e ER (para a síntese de lípidos e o tráfico de proteína), mas também com os lisossomas, endossomas, e os vacúolos induzidas por bactérias intracelulares 7. Com efeito bactérias, vírus, parasitas e mesmo alvo gotículas lipídicas para replicação e persistência, entre os quais o HCV 8.
Infecção pelo HCV é uma das principais causas de morbidade relacionada com o fígado e mortalidade no mundo, respondendo por cerca de 0,5 milhões de mortes por ano 9. O verdadeiro número de infecções por HCV é desconhecida, mas as estimativas recentes sugerem que 130 – 150 milhões de pessoas estão cronicamente infectadas. Sem vaccine existe, mas os antivirais de actuao directa recentemente aprovados aumentar dramaticamente a resposta terapêutica em comparação com a terapia à base de interferão padrão. No entanto, em todo o mundo, o tratamento de pacientes provavelmente será restrito devido aos custos extremamente elevados das novas terapias. Cerca de metade de todos os indivíduos cronicamente infectados com VHC desenvolvem a doença de fígado gordo (esteatose), uma condição caracterizada pela acumulação excessiva de gotículas lipídicas em hepatócitos. De forma intrigante, gotículas lipídicas também surgiu como organelos celulares vitais para a replicação do HCV, putativamente servir como locais de montagem virais 10, 11.
Em células infectadas com HCV, a proteína do núcleo virai e NS5A localizar de gotículas lipídicas em um processo de que depende a biossíntese de triglicéridos, como inibidores de diacilglicerol aciltransferase-1 (DGAT1) prejudicar o tráfico de gotículas lipídicas e subsequente produção de partículas de HCV 12 </sup>, 13, 14, 15. Além disso, as mutações nos domínios de ligação de gotículas lipídicas de qualquer núcleo ou NS5A suprimir montagem de VHC 16, 17. Núcleo e, em seguida, NS5A recrutar todas as outras proteínas virais, bem como complexos de replicação do ARN viral, para as membranas estreitamente associadas com lípidos gotas 16. É necessária uma acção concertada de todas as proteínas virais para a produção bem sucedida de progenitura viral infecciosa 10, 11. As proteínas estruturais são parte dos viriões, e as proteínas não estruturais promovem as interacções proteína-proteína necessárias para este processo. Curiosamente, o bona fide lípido-proteína de ligação de gotículas PLIN3 / TIP47 é necessário para a replicação do ARN de HCV e a libertação de viriões de 18, 19 <sup>, 20. Apesar destes avanços recentes, os detalhes mecanísticos, especialmente das interacções vírus-hospedeiro durante as fases tardias da replicao do HCV, permanece mal definida, e a função precisa das gotículas lipídicas é desconhecido.
Aqui, descrevemos um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas. Utilizando este método, foram encontradas alterações profundas no proteoma gotícula de lípido, durante a infecção pelo HCV e identificado anexina A3 como uma proteína hospedeira que co-fracciona com gotículas lipídicas e é necessário para a maturação de HCV eficiente 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para isolar gotículas lipídicas para análise quantitativa do proteoma gotícula de lípido para comparar o enriquecimento e empobrecimento de proteínas associadas com gotículas lipídicas sob diversas condições de cultura, tais como infecções virais. Como um método alternativo, a análise do proteoma pode ser realizada com quantificações, livre de marcador com base no total de intensidades de pico. Este método não tem nenhuma limitação da gama dinâmica e evita problemas me…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos R. Bartenschlager (Universidade de Heidelberg) para as construções JC1, CM Rice (Universidade Rockefeller) para as células Huh7.5, J. McLauchlan (Virologia Unidade Medical Research Council) para o JFH1 construir, T. Wakita (Instituto Nacional de Doenças infecciosas, Japão) para o JFH1 e B. Webster e WC Greene (Instituto Gladstone de Virologia e Imunologia) para as construções repórter HCVcc. Este trabalho foi apoiado por fundos da DFG (HE 6889 / 01/02 (EH), INST 337 / 15-1 2013, e INST 337 / 16-1 2013 (SH)). O Instituto Heinrich Pette, do Instituto Leibniz para Experimental Virologia é apoiado pela Cidade Livre e Hanseática de Hamburgo e do Ministério Federal da Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM | Thermo Fisher | 89983 |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 |
| Roti-Blue 5x-Concentrate | Roth GmbH | A152.2 |
| 10x SDS-Tris-Glycine – Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml |
| PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 |
| Protease Inhibitor Cocktail 5ml | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 |
| Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 |
| NP-40 | AppliChem | A1694 |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 |
| M6PRB1/TIP47 100µg | abcam | ab47639 |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F |
| Anti-ß-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl |
| Ethanol absolute | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 |
| 96 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 |
| Terumo Syringe 1 ml | Terumo | SS-01T |
| Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 – 168381 |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 |
| Tube, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 |
| Orbitrap Fusion | ||
| Branson Sonifier 450 | ||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml | Eppendorf | 5355 000.127 |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
Referências
- Thiam, A. R., Farese, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
- Kory, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
- Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).
- Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
- Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide – filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
- Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
- Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
- Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
- Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
- Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
- Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
- Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
- Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
- Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
- Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
- Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
- Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
- Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3′ untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
- Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
- Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3’UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).
