Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento
Summary
A técnica de genotipagem descrito aqui, que acopla reacção em cadeia da polimerase fluorescente (PCR) para electroforese em gel capilar, permite a genotipagem de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. É contorna as limitações enfrentadas por outras técnicas de genotipagem e é mais rentável do que os métodos de sequenciação.
Abstract
O desenvolvimento de ferramentas de edição de genoma programáveis tem facilitado o uso de genética reversa para entender os papéis sequências genómicas específicas desempenhar no funcionamento das células e organismos inteiros. Esta causa foi tremendamente ajudado pela recente introdução do CRISPR / sistema-a cas9 ferramenta versátil que permite aos pesquisadores para manipular o genoma e transcriptoma, a fim de, entre outras coisas, bater para fora, derrubar ou bater em genes em um alvo maneira. Para o propósito de bater para fora de um gene, CRISPR / cas9 mediada por quebras de cadeias duplas recrutar a via de reparação do ADN-joining final não homóloga para introduzir a inserção de frameshift-causando ou eliminação de nucleótidos no local da fractura. No entanto, um ARN guia individual pode provocar indesejáveis efeitos fora do alvo, e para eliminar essas possibilidades, o uso de vários ARNs de guia é necessário. Esta multiplicidade de alvos também significa que é necessária uma pesquisa de elevado volume de clones, o que por sua vez, levanta a utilização de uma efficiente técnica de alto rendimento para genotipar os clones knockout. técnicas de genotipagem actual, quer sofre de limitações inerentes ou incorrer em elevados custos, por conseguinte, tornando-as inadequadas para fins de alto rendimento. Aqui, nós detalhe o protocolo para a utilização de PCR fluorescente, que utiliza o ADN genómico a partir de lisado celular em bruto como um molde, e em seguida resolver os fragmentos de PCR por meio de electroforese em gel capilar. Esta técnica é preciso o suficiente para diferenciar uma diferença de pares de bases entre os fragmentos e, por conseguinte, é adequado em indicar a presença ou ausência de um desvio de enquadramento na sequência de codificação do gene alvo. Este conhecimento preciso impede efetivamente a necessidade de um passo de procedimento de confirmação e permite aos usuários economizar tempo e custos no processo. Além disso, esta técnica tem provado ser versátil na genotipagem de várias células de mamífero de várias origens de tecido alvo de ARN de guia contra numerosos genes, como mostrado aqui e noutros locais.
Introduction
abordagens de genética reversa permitiram aos cientistas elucidar os efeitos de alterações específicas no genoma da célula ou organismo todo. Por exemplo, a expressão de um gene particular pode ser atenuado pelo gene knockdown 1, 2 (redução parcial) ou nocaute do gene 3, 4 (ablação completa), a fim de determinar o efeito que este possui sobre a função da célula ou sobre a desenvolvimento do organismo.
experimentos gene knockout tornaram-se mais fácil uma vez que a introdução de nucleases programáveis específicas das sequências, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e de transcrição nucleases efectoras activadores-like (TALENS). No entanto, a caracterização relativamente recente da agrupado regularmente intercaladas curta repetição palíndromo (CRISPR) / sistema cas9 tornou extremamente fácil para qualquer laboratório em todo o mundo para realizar gene experimentos nocaute. Em essência, o sistema / cas9 CRISPR consiste de dois componentes de um único ARN essenciais guia (sgRNA), que reconhece e liga-se através da complementaridade de base para uma sequência específica no genoma, e uma endonuclease chamado cas9. As consequências da acção de ligação e específico do complexo sgRNA-cas9 no ADN genómico representa a clivagem de cadeia dupla de ADN. Este, por sua vez, acciona o mecanismo de resposta de dano de DNA na célula, a qual é subsequentemente reparadas através das vias (HR) de linha de junção (NHEJ) ou de recombinação homóloga não homólogas. Uma vez que o mecanismo de NHEJ de reparação (mas não o mecanismo de RH) muitas vezes resulta na inserção aleatória ou eliminação de nucleótidos no local de reparação, resultando na inserção / deleção (InDel) mutações, ele pode fazer com que o quadro de leitura de um exão de mudar. Isto pode resultar em seguida, o nocaute do gene devido à terminação prematura da tradução e deterioração mediado por mutações nonsense 5, 6,7.
Apesar da conveniência proporcionada pela introdução do sistema / cas9 CRISPR em batendo para fora de um gene, a genotipagem de clones de células alvo permanece um gargalo, especialmente em um ajuste 8, 9 de alto rendimento. técnicas existentes tanto sofrem grandes limitações inerentes ou são financeiramente caro. Por exemplo, o ensaio inspector ou T7E1, que é um ensaio enzimático que detecta erros de emparelhamento em DNA duplexes 10, não é capaz de distinguir entre os clones de tipo selvagem e mutantes homozigicos (clones cujos alelos s mutados de forma idêntica), uma vez que estes clones têm alelos idênticos e, portanto, não apresentam erros de emparelhamento na sua sequência de ADN 11. Além disso, a utilização de sequenciação de Sanger, que é considerada o padrão de ouro na genotipagem de clones mutantes, em uma instalação de alto rendimento é indesejável devido ao seu elevado custo. Aqui, apresentamos um detailed protocolo da técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente, que pode contornar as limitações das outras técnicas de genotipagem existentes e é particularmente útil na realização de um ecrã de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. Este método é tecnicamente simples de executar e economiza tempo e custo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O batendo para fora de um gene específico de uma linha de células de modelo de escolha se tornou rotina para elucidar o papel do gene que desempenha nesse contexto celular particular. Na verdade, várias telas genome-wide estão actualmente disponíveis que utilizam o sistema CRISPR / cas9 para alvejar genes humanos virtualmente todos conhecidos no genoma 14, 15, 16. Com estas telas de grande escala (ou mesmo em pequena escal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Ms. Tan Shi Min, Ms. Helen Ong, e Dr. Zhao Yi para ajudar com os experimentos de eletroforese em gel capilar. Este trabalho foi apoiado por NMRC / IRG conceder NMRC / 1314/2011 e MOE ACRF Tier 2 subvenção do Fundo MOE2011-T2-1-051.
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
Referências
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O’Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
