マウスモデルにおける覚醒時膀胱内圧測定の実施手順の評価
Summary
本研究では、自由に動くマウスで覚醒膀胱内圧測定を行うための手術手順と実験技術について述べる。さらに、最適化と標準化をサポートする実験的証拠を提供します。
Abstract
覚醒充填膀胱内圧測定は、自由に動くマウスの膀胱機能を評価するために長い間使用されてきたが、使用される具体的な方法は実験室によって異なる。この研究の目的は、膀胱内チューブを埋め込むために使用される顕微手術手順と、覚醒し、自由に動くマウスに膀胱圧を記録するための実験技術を記述することであった。さらに、手術データ、管の種類およびサイズが下部尿路機能および記録感度にどのように影響するかを示すための実験データを提示する。圧力記録に対するチューブ直径の影響は、異なる内径を有するポリエチレンおよびポリウレタンチューブの両方で評価された。続いて、両方の材料から得られた最も優れたチューブを、雄のC57BL / 6マウスの膀胱のドームに外科的に移植した。手術後2、3、5、および7日目に、健康で無傷の動物および動物に、12時間の一晩排尿頻度を記録した。収穫時に、膀胱肉眼観察を用いて腫脹の徴候を評価し、続いて病理学的分析のために処理した。 2および3日目に膀胱腫脹の最大限度が観察され、有意に膀胱機能障害を示す行動排尿データと相関した。 5日目までに、膀胱組織学および排尿頻度が正常化した。我々の研究で得られた文献と証拠に基づき、我々は、覚醒マウスの膀胱内圧および空隙体積のインビボ記録のための以下のステップを提案する：1）手術顕微鏡および顕微手術ツールを用いて手術を行う、2）ポリエチレン-10 3）膀胱膨潤が解消した術後5日目に膀胱内圧測定を行う。
Introduction
充填膀胱内圧測定法（FC）は、膀胱充填が遅い間に圧力を記録するためにカテーテルを膀胱内に配置することを含む診断方法である。下部尿路機能を評価するための臨床診断法として1927年に初めて導入されたが、現在でも広く使用されている。研究アプリケーションでは、FCを使用して、健常な動物モデルおよび罹患動物モデルの膀胱機能を試験し、薬理学的作用物質の効果を研究することができる。げっ歯類動物モデルは、下部尿路機能を調査するために一般的に使用される。 2この哺乳動物群では、FCはラットでの使用のために最初に開発された。 3ここで、チューブを膀胱に埋め込み、FCを行う方法は、許容可能なレベルの再現性を有する多くの研究者によってよく記述され、使用されている。 4トランスジェニックおよびノックアウト株の利用可能性は、マウスを数多くの研究分野にとって貴重な種にし、下部尿路機能不全の分野を含む。マウス膀胱内圧測定を実施するために使用される方法論は、実験室間でかなり異なるため、結果を比較することが困難である。 5
エキソビボモデルと比較して、FCは下部尿路の解剖学的構造を保存し、排尿サイクルの貯蔵および排尿段階の間に膀胱とその出口との協調機能を評価することができる。以前の研究は、多くの一般的に使用される麻酔薬が排尿収縮を抑制することを示しています。膀胱平滑筋収縮（ウレタン、α-クロラロース、ケタミン、キシラジン）を維持し、動物を麻酔させる薬剤は、機能性膀胱容量を有意に低下させ、神経伝達を抑制する。 6、7、8、9技術的に難しいが、FCはaw動物を徘徊することは、排尿反射の機能的完全性を保存する。
下部尿路機能は、術後膀胱壁の腫脹、痛みおよび不快感によるストレス、および環境への影響を含む複数の要因によって影響される。管移植中の組織損傷を最小限に抑える外科技術と、管運動を減少させ、動物を自由に歩行させる記録方法を使用することは、正確で再現性のある記録を得る上で不可欠である。
適切に実施される場合、in vivo 自由に動く動物のFCは、生理学的膀胱機能を確実に反映するデータを提供することができる。 10自由に動く動物のFCは、以下のパラメータに関するデータを提供することができます。基礎またはベースライン圧力：2回の排尿間の最低圧力。相互排尿圧：2回の排尿間の平均圧力。閾値圧力：膀胱内圧imm排尿前に瀉血する。最大圧力：排尿サイクル中の最大膀胱圧。自発的活動（または平均交互咬合圧）：交絡圧 – 基底圧。非空隙収縮：液体の放出に関連しない充填段階中の膀胱内圧の上昇。膀胱遵守：膀胱容量を閾値圧力 – 基底圧で割った値。排尿頻度：単位時間当たりの排尿回数。インターミッション間隔：2つの最大ボイド圧力の間の期間。膀胱容量：注入量を排尿回数で割った値。これらのパラメータおよび標準化された用語の詳細な説明はこれまでに公開されています。 11
FCは、連続または単サイクルの膀胱内注入法を用いて行うことができる。連続的な膀胱内圧測定により、複数回の排尿サイクルを記録し、再現性について。膀胱容量の測定精度は、残量が不明であるため制限されます。さらに、自由に移動するマウスでは、小さな空隙量（ひずみと性別に基づいて30〜184μL）を収集することは困難です。この方法を用いて空隙体積を記録することは、麻酔された製剤と比較してあまり正確ではないが、膀胱機能に対する麻酔薬の抑制効果を回避する点で優れている。膀胱容量を評価するには、単一サイクル膀胱内圧測定法を用いるべきである。この方法では、膀胱は、注入前に吸引によって空にされ、容量は、注入速度に時間から最大圧力までの関数として計算される。
小型げっ歯類で膀胱内圧測定を行う技術は公開されているが、ラットで行われた手術を記載し、マウス膀胱内圧測定をウレタン麻酔下で行うべきであると勧告した。 10このコミュニケーションの目標はtですo膀胱のドームに膀胱内チューブを埋め込むために使用される顕微手術技術と、膀胱の詰まった状態および覚醒している自由に動くマウスにおける排尿の持続中に、下部尿路機能をインビボで記録するために用いられる実験装置の両方を記載する。さらに、チューブ内の長さ、直径および材料ならびにインビボ FCを実施する方法が記録にどのように影響を及ぼすかについての実験が行われた。この実験プロトコルは、以前に公開された技術を要約し、実験結果に基づいて多くの変更を提案する。
Protocol
Representative Results
Discussion
膀胱内チューブの最適な材料およびサイズ
チュービングの直径が圧力記録に及ぼす影響を決定するために、我々は異なるマイクロ流体チューブを試験した。 PE50（0.58mm ID）、ポリウレタンPU027（0.4mm ID）、PE25（0.46mm ID）、およびPE10（0.28mm ID）。各チューブについて、チューブを0〜30cmの範囲で垂直方向に急速に動かしながら、1mL /時で注入ポンプを作動させて圧力を記録した…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by the Department of Surgery University of Vermont, Danish Council for Independent Research, and by the Odense University Hospital.
Materials
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22ga single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing – Cut to length |
| 22G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100°C) – Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5ml/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2-20X) | Leica Microsystems | Magnification |
Referências
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