Evaluación del procedimiento para realizar cistometría despierta en un modelo de ratón
Summary
Este estudio describe los procedimientos quirúrgicos y técnicas experimentales para realizar cistometría despierta en un ratón que se mueve libremente. Además, proporciona evidencia experimental para apoyar su optimización y estandarización.
Abstract
La cistometría de llenado despierto se ha utilizado durante mucho tiempo para evaluar la función de la vejiga en ratones que se mueven libremente, sin embargo, los métodos específicos utilizados varían entre los laboratorios. El objetivo de este estudio fue describir el procedimiento microquirúrgico utilizado para implantar un tubo intravesical y la técnica experimental para registrar la presión de la vejiga urinaria en un ratón despierto y de movimiento libre. Además, los datos experimentales se presentan para mostrar cómo la cirugía, así como el tipo de tubo y el tamaño, afectan la función del tracto urinario inferior y la sensibilidad de grabación. El efecto del diámetro del tubo sobre el registro de presión se evaluó tanto en tubos de polietileno como de poliuretano con diferentes diámetros internos. Posteriormente, el tubo de mejor rendimiento de ambos materiales se implantó quirúrgicamente en la cúpula de la vejiga urinaria de ratones C57BL / 6 macho. Se registró una frecuencia de micturación de doce horas durante toda la noche en animales sanos e intactos 2, 3, 5 y 7 días después de la cirugía. En la cosecha, vejigas wSe evaluaron los signos de hinchamiento utilizando la observación bruta y se procesaron posteriormente para el análisis patológico. La mayor extensión de hinchazón de la vejiga se observó en los días 2 y 3, que se correlacionó con los datos de micción conductual que muestran una función vesical significativamente deteriorada. Al día 5, la histología de la vejiga y la frecuencia de micción se habían normalizado. Basado en la literatura y la evidencia proporcionada por nuestros estudios, proponemos los siguientes pasos para el registro in vivo de la presión intravesical y el volumen de vacío en un ratón despierto: 1) Realizar la cirugía con un microscopio operativo y herramientas microquirúrgicas, 2) Utilizar polietileno-10 Tubería para minimizar los artefactos de movimiento, y 3) realizar cistometría en el día 5 postoperatorio, cuando se disuelve la hinchazón de la vejiga.
Introduction
La cistometría de llenado (FC) es un método de diagnóstico que consiste en colocar un catéter en la vejiga urinaria para registrar la presión durante el llenado lento de la vejiga. Introducido por primera vez en 1927 como un método de diagnóstico clínico para evaluar la función del tracto urinario inferior, se ha mantenido ampliamente utilizado. 1 En aplicaciones de investigación, el FC puede usarse para probar la función de la vejiga en modelos animales sanos y enfermos y para estudiar los efectos de los agentes farmacológicos. Modelos animales de roedores se utilizan comúnmente para investigar la función del tracto urinario inferior. 2 En este grupo de mamíferos, FC se desarrolló por primera vez para su uso en ratas. 3 Aquí, la metodología para implantar un tubo en la vejiga urinaria y realizar CF ha sido bien descrita y utilizada por muchos investigadores con un nivel aceptable de reproducibilidad. La disponibilidad de cepas transgénicas y knock out hace de los ratones una especie valiosa para numerosas áreas de investigación,Incluyendo el campo de la disfunción del tracto urinario inferior. La metodología utilizada para realizar la cistometría del ratón varía apreciablemente entre los laboratorios, lo que dificulta la comparación de los resultados. 5
En comparación con los modelos ex vivo , FC preserva la anatomía del tracto urinario inferior, permitiendo evaluar la función coordinada entre la vejiga y su salida durante las fases de almacenamiento y micción del ciclo miccional. La investigación anterior demuestra que los anestésicos numerosos, de uso general suprimen la contracción de la micción. Los agentes que preservan la contracción del músculo liso de la vejiga urinaria (uretano, α-cloralosa, ketamina y xilazina), permitiendo al animal miccionarte, todavía reducen significativamente la capacidad funcional de la vejiga y suprimen la neurotransmisión. 6 , 7 , 8 , 9 Aunque técnicamente más desafiante, el FC realizado en awLos animales ambulantes preservan la integridad funcional del reflejo de la micción.
La función del tracto urinario inferior está influenciada por múltiples factores, incluyendo el hinchamiento post-operatorio de la pared de la vejiga, el estrés debido al dolor y la incomodidad, y las influencias ambientales. El uso de una técnica quirúrgica que minimiza el daño tisular durante la implantación del tubo y los métodos de registro que reducen el movimiento del tubo, mientras que simultáneamente permite que el animal se mueva libremente, son esenciales para obtener grabaciones precisas y reproducibles.
Si se realiza adecuadamente, in vivo FC en animales que se mueven libremente puede proporcionar datos que reflejen fiablemente la función fisiológica de la vejiga. 10 FC en animales en movimiento libre puede proporcionar datos sobre los siguientes parámetros; Presión basal o basal: Presión mínima entre dos micciones. Presión de la intermitencia: Presión media entre dos micciones. Presión umbral: Presión intravesical immAntes de la micción. Presión máxima: Presión máxima de la vejiga durante un ciclo de micción. Actividad espontánea (o media oscilatoria de la intermitución): Presión de la interfunción menos presión basal. Contracciones no votivas: Aumento de la presión intravesical durante la fase de llenado, no asociado con la liberación de líquido. Cumplimiento de la vejiga: Capacidad de la vejiga dividida por la presión umbral menos la presión basal. Frecuencia de micción: Número de micciones por unidad de tiempo. Intervalo de intermitencia: Período entre dos presiones de vacío máximas. Capacidad de la vejiga: Volumen infundido dividido por el número de micciones. Se ha publicado previamente una descripción detallada de estos parámetros y una terminología estandarizada. 11
FC se puede realizar utilizando un método de infusión intravesical de ciclo único o continuo. La cistometría continua permite registrar múltiples ciclos de micción y seleccionar datos representativos basados enSobre la reproducibilidad. Su precisión en la medición de la capacidad de la vejiga está limitada debido al volumen residual desconocido. Además, es difícil recolectar pequeños volúmenes anidados (que basados en la tensión y el sexo varían entre 30 y 184 μL) en ratones que se desplazan libremente. El uso de este método para registrar el volumen anulado es menos preciso en comparación con una preparación anestesiada, pero es superior en cuanto que evita los efectos supresores de los anestésicos sobre la función de la vejiga. Se debe usar cistometría de ciclo único para evaluar la capacidad de la vejiga. En este método, la vejiga se vacía por aspiración antes de la infusión y la capacidad se calcula como una función de la velocidad de infusión multiplicada por el tiempo hasta la presión máxima.
Aunque se ha publicado la técnica de realizar cistometría en roedores pequeños, describió la cirugía realizada en una rata y recomendó que la cistometría del ratón se realizara bajo anestesia con uretano. 10 El objetivo de esta comunicación esO describir las técnicas microquirúrgicas utilizadas para implantar un tubo intravesical en la cúpula de la vejiga urinaria y la configuración experimental utilizada para registrar la función del tracto urinario inferior, in vivo , durante el llenado continuo de la vejiga y la micción en un ratón despierto que se mueve libremente. Además, se realizaron experimentos para determinar cómo la longitud, el diámetro y el material de los tubos, así como la metodología para realizar FC in vivo , afectan a la grabación. Este protocolo experimental resume técnicas previamente publicadas y propone una serie de modificaciones basadas en resultados experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Material óptimo y tamaño de la tubería intravesical
Para determinar el efecto del diámetro del tubo en las grabaciones de presión, hemos probado diferentes tubos microfluídicos; PE50 (0,58 mm ID), poliuretano PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) y PE10 (0,28 mm ID). Para cada tubo, se registró presión con la bomba de infusión funcionando a 1 ml / h, mientras que se desplazaba rápidamente el tubo verticalmente de 0 a 30 cm. Los ensayos iniciales in vivo intentaron usar la tubería PE50…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by the Department of Surgery University of Vermont, Danish Council for Independent Research, and by the Odense University Hospital.
Materials
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22ga single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing – Cut to length |
| 22G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100°C) – Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5ml/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2-20X) | Leica Microsystems | Magnification |
Referências
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