Utvärdering av förfarandet för att utföra vakencystometri i en musmodell
Summary
Denna studie beskriver kirurgiska ingrepp och experimentella tekniker för att utföra vaken cystometri i en fritt rörlig mus. Dessutom ger det experimentella bevis för att stödja dess optimering och standardisering.
Abstract
Uppvakningsfyllnadscystometri har länge använts för att utvärdera blåsfunktionen hos fritt rörliga möss, men de specifika metoder som används varierar mellan laboratorier. Målet med denna studie var att beskriva det mikrokirurgiska förfarandet som användes för att implantera ett intravesiskt rör och den experimentella tekniken för att registrera urinblåstrycket i en vaken, fritt rörlig mus. Dessutom presenteras experimentella data för att visa hur kirurgi, såväl som slangartyp och -storlek, påverkar nedre urinvägsfunktionen och inspelningskänsligheten. Effekten av rördiametern vid tryckregistrering bedömdes i både polyeten- och polyuretanrör med olika inre diametrar. Därefter implanterades det bästa utförande röret från båda materialen kirurgiskt in i kupolen i urinblåsan hos manliga C57BL / 6-möss. Tolv timmars miktureringsfrekvens över natten registrerades i friska, intakta djur och djur 2, 3, 5 och 7 dagar efter operationen. Vid skörd, blåsor wUtvärderas för tecken på svullnad med användning av bruttobservation och behandlades därefter för patologisk analys. Den största delen av blåsans svullnad observerades på dag 2 och 3, vilket korrelerade med beteendestörande data som visade signifikant nedsatt blåsfunktion. Vid dag 5 hade blåsans histologi och voiding frekvens normaliserats. Baserat på litteraturen och bevisen från våra studier, föreslår vi följande steg för in vivo inspelning av intravesiskt tryck och volymen i en vaken mus: 1) Utför operationen med hjälp av ett operativt mikroskop och mikrokirurgiska verktyg, 2) Använd polyeten-10 Rör för att minimera rörelseartefakter, och 3) Utför cystometri på postoperativ dag 5, när blåsans svullnad löser sig.
Introduction
Fyllning av cystometri (FC) är en diagnostisk metod som innebär att man placerar en kateter i urinblåsan för att registrera tryck under långsam blåsning. Först infördes 1927 som en klinisk diagnostisk metod för att utvärdera nedre urinvägsfunktionen, har den fortsatt stor användning. 1 I forskningsapplikationer kan FC användas för att testa blåsans funktion i friska och sjuka djurmodeller och att studera effekterna av farmakologiska medel. Gnagdjursmodeller används ofta för att undersöka nedre urinvägsfunktionen. 2 I denna grupp däggdjur utvecklades FC först för användning hos råttor. 3 Metoden att implantera ett rör i urinblåsan och utföra FC har väl beskrivits och använts av många forskare med en acceptabel reproducerbar nivå. 4 Tillgängligheten av transgena och utjämningsstammar gör möss till en värdefull art för många forskningsområden,Inklusive området för nedre urinvägar dysfunktion. Metoden som används för att utföra muscystometri varierar avsevärt mellan laboratorier, vilket gör det svårt att jämföra resultat. 5
Jämfört med ex vivo- modeller, bevarar FC lägre urinvägsanatomi, vilket möjliggör att den samordnade funktionen mellan blåsan och dess utlopp under lagrings- och voidingfasen hos micturitionscykeln ska bedömas. Tidigare forskning visar att många, allmänt använda anestetika undertrycker micturitionssammandragning. Agenter som bevarar urinblåsans glattmuskelkontraktion (uretan, a-kloralos, ketamin och xylazin), vilket gör att djuret mikturerar, ändå signifikant minskar funktionell blåskapacitet och undertrycker neurotransmission. 6 , 7 , 8 , 9 Även om tekniskt mer utmanande utförde FC i awAke ambulerande djur bevarar den funktionella integriteten hos micturitionsreflexen.
Lägre urinvägsfunktion påverkas av flera faktorer, inklusive postoperativ blåsväggsvullnad, stress på grund av smärta och obehag och miljöpåverkan. Med hjälp av en kirurgisk teknik som minimerar vävnadsskada under rörimplantation och inspelningsmetoder som minskar rörrörelsen, samtidigt som djuret tillåter ambulering, är det viktigt att få noggranna och reproducerbara inspelningar.
Om det utförts tillräckligt, in vivo FC i fritt rörliga djur kan tillhandahålla data som på ett tillförlitligt sätt speglar fysiologisk blåsfunktion. 10 FC i fritt rörliga djur kan tillhandahålla data om följande parametrar; Basalt eller baslinjetryck: Minsta tryck mellan två mikturer. Intermicturition press: Medel tryck mellan två micturitions. Tröskeltryck: Intravesical pressure immRedaktivt före mikturen. Maximalt tryck: Maximalt blåstryck under en miktureringscykel. Spontan aktivitet (eller medelvärde mellan oscillerande tryck): Intermiktureringstryck minus basaltryck. Non-voiding contractions: Ökning av intravesikal tryck under fyllningsfasen, inte associerat med frisättning av vätska. Blåsans överensstämmelse: Blåskapacitet dividerad med tröskeltryck minus basaltryck. Micturitionsfrekvens: Antal micturitions per tidsenhet. Intermicturitionsintervall: Period mellan två maximala lufttryck. Blåskapacitet: Infunderad volym dividerat med antalet mikturer. En detaljerad beskrivning av dessa parametrar och standardiserad terminologi har tidigare publicerats. 11
FC kan utföras med en intravesisk infusionsmetod med kontinuerlig eller enstaka cykel. Kontinuerlig cystometri möjliggör registrering av flera micturitionscykler och val av representativ databasOm reproducerbarhet. Dess noggrannhet vid mätning av blåskapaciteten är begränsad på grund av den okända restvolymen. Dessutom är det utmanande att samla små volymer (som är baserade på stam och sex varierar mellan 30 och 184 μL) i fritt ambulerande möss. Genom att använda denna metod för att spela in volymen är mindre noggrann jämfört med en bedövad beredning, men det är överlägsen, eftersom det undviker narkotikas undertryckande effekter på blåsfunktionen. Cystometri med encykel bör användas för att bedöma blåskapaciteten. I denna metod töms blåsan genom aspiration före infusion och kapaciteten beräknas som en funktion av infusionshastigheten multiplicerad med tiden till det maximala trycket.
Även om tekniken för att utföra cystometri i små gnagare har publicerats beskrev den operationen som utfördes i en råtta och rekommenderade att muscystometri skulle utföras under uretananestesi. 10 Målet med denna kommunikation är tO beskriva både de mikrokirurgiska teknikerna som används för att implantera ett intravesiskt rör i urinblåsans kupol och den experimentella uppställningen som används för att registrera nedre urinvägsfunktionen in vivo under kontinuerlig blåsfyllning och mikturion i en vaken, fritt rörlig mus. Dessutom utfördes försök för att ta itu med hur tublängden, diameteren och materialet, liksom metoden för att utföra in vivo FC, påverkar inspelningen. Detta experimentella protokoll sammanfattar tidigare publicerade tekniker och föreslår ett antal modifieringar baserat på experimentella resultat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optimal material och storlek på intravesikalröret
För att bestämma vilken effekt tubdiametern har på tryckinspelningar testade vi olika mikrofluidiska rör; PE50 (0,58 mm ID), polyuretan PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) och PE10 (0,28 mm ID). För varje rör registrerades tryck med infusionspumpen som kördes vid 1 ml / h, medan röret rör sig snabbt vertikalt från 0 till 30 cm. Initiala in vivo-försök försökte använda PE50-rör, men misslyckades på grund av rörets storlek jä…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by the Department of Surgery University of Vermont, Danish Council for Independent Research, and by the Odense University Hospital.
Materials
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22ga single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing – Cut to length |
| 22G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100°C) – Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5ml/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2-20X) | Leica Microsystems | Magnification |
Referências
- Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. The nonstop transvesical cystometrogram in urethane-anesthetized rats: a simple procedure for quantitative studies on the various phases of urinary bladder voiding cycle. J Pharmacol Methods. 15 (2), 157-167 (1986).
- Malmgren, A., et al. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J Urol. 137 (6), 1291-1294 (1987).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (4), F1248-F1253 (2008).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19 (1), 87-99 (2000).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Peripheral Nerve Transplantation Combined with Acidic Fibroblast Growth Factor and Chondroitinase Induces Regeneration and Improves Urinary Function in Complete Spinal Cord Transected Adult Mice. PLoS One. 10 (10), e0139335 (2015).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury–a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. J Vis Exp. (66), (2012).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30 (5), 636-646 (2011).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol Urodyn. 29 (7), 1344-1349 (2010).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of High Fat Diet Feeding for 20 Weeks on Lower Urinary Tract Function in Mice. Low Urin Tract Symptoms. 5 (2), 101-108 (2013).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (12), F1369-F1378 (2015).
- Morikawa, K., et al. Effects of various drugs on bladder function in conscious rats. Jpn J Pharmacol. 50 (4), 369-376 (1989).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251 (6 Pt 2), R1177-R1185 (1986).
- Cornelissen, L. L., Misajet, B., Brooks, D. P., Hicks, A. Influence of genetic background and gender on bladder function in the mouse. Auton Neurosci. 140 (1-2), 53-58 (2008).
- Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase. J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).
