Imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores das subpopulações de células T em amostras de carcinoma de células escamosas humano oftaríngeas fixadas em formalina, arquivadas, formadas por formalina
Summary
A imuno-histoquímica de fluorescência multiparamétrica pode ser usada para avaliar o número, a distribuição relativa e a localização das populações de células imunes no microambiente do tumor. Este manuscrito descreve o uso desta técnica para analisar subpopulações de células T no câncer orofaríngeo.
Abstract
A técnica de imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores (IHC) é um método para quantificar populações de células de interesse, levando em consideração sua distribuição relativa e sua localização no tecido. Esta técnica tem sido amplamente aplicada para estudar o infiltrado imunitário em vários tipos de tumores. O microambiente do tumor é infiltrado por células imunes que são atraídas para o local do tumor. Diferentes populações de células imunológicas têm desempenhado diferentes papéis no microambismo do tumor e têm um impacto diferente no resultado da doença. Este manuscrito descreve o uso de ICC de fluorescência multiparamétrica no carcinoma de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) como exemplo. Esta técnica pode ser estendida a outras amostras de tecido e tipos celulares de interesse. No estudo apresentado, analisamos o compartimento intra-epitelial e estromal de uma grande coorte de OPSCC (n = 162). Concentramo-nos em linfócitos T totais (CD3 + ), regulação imunossupressoraCélulas T (Tregs, ie, FoxP3 + ) e T helper 17 (Th17) ( ie, IL-17 + CD3 + ) usando uma contra-prova nuclear para distinguir o epitélio tumoral do estroma. Um número alto de células T encontrou-se correlacionado com uma melhor sobrevivência livre de doença em pacientes com um número baixo de células não T T-17 + intratumorais. Isso sugere que as células T não-T IL-17 + podem estar correlacionadas com uma resposta imune pobre no OPSCC, o que está de acordo com a correlação descrita entre a IL-17 e a fraca sobrevivência em pacientes com câncer. Atualmente, novas técnicas de IHC de fluorescência multiparamétrica estão sendo desenvolvidas usando até 7 fluorocromos diferentes e permitirão uma caracterização e localização mais precisa das células imunes no microambiente do tumor.
Introduction
Os carcinomas de células escamosas orofaríngeas (OPSCCs) são um grupo heterogêneo de câncer de células escamosas originadas na orofaringe. Os fatores de risco para o OPSCC incluem infecção por papilomavírus humano (HPV) e álcool e tabaco 1 , 2 . O papel da resposta imune e como usar isso em um cenário clínico está apenas começando a ser explorado. O microambiente do tumor é infiltrado por células imunes que são atraídas pelo site do câncer. Embora uma alta freqüência de células T citocíticas CD8 + tenha sido correlacionada com a sobrevivência melhorada em pacientes com OPSCC 3 , o papel de outros subconjuntos de células T, incluindo células Tregs e Th17, ainda não está claro 4 . Considerando que as células Th1 e Th17 devem ajudar na resposta imune dirigida às células tumorais, as Tregs são bem conhecidas por suas habilidades para suprimir a atividade de outras células T 5 . No entanto, a presença de TRegs encontrou-se correlacionar com respostas favoráveis e desfavoráveis em diferentes tipos de tumor 6 . Uma vez que nem todas as células imunes presentes no sangue infiltram o tumor na mesma extensão, estudar o microambiente tumoral local fornece a medida mais confiável da resposta imune dirigida contra o tumor. O objetivo deste estudo é determinar a correlação entre os números e os tipos de células imunes e o desfecho clínico. Usamos imagens de IHC de fluorescência de quatro cores para analisar o número e a localização de várias subpopulações de células T no OPSCC humano.
Concentramo-nos em linfócitos T totais (CD3 + ), células Th17 e Tregs FoxP3 + imunossupressores, cuja via de diferenciação está intimamente relacionada às células Th17. As células Th17 são caracterizadas pela combinação de CD3 e IL-17. A citocina IL-17 também pode ser produzida por células não-T 7 . Determinamos a distribuição do intrapinteCélulas T helicoidais e estromáticas, Tregs, Th17 e IL-17 + células não-T em uma grande série de casos de OPSCC e analisou as correlações com a sobrevivência do paciente. A fluorescência multicolor IHC foi utilizada para identificar a expressão de CD3, Foxp3 e IL-17, em combinação com uma contra-prova DAPI. Este ensaio permitiu a identificação fácil e clara de ambas as células tumorais (utilizando a coloração nuclear DAPI) e as populações de células T infiltrantes (utilizando uma combinação de diferentes marcadores). Após a preparação e coloração da amostra, utilizou-se um microscópio fluorescente e um software de imagem para separar as diferentes cores fluorescentes usadas e determinar o número e o tipo de células presentes tanto no epitélio tumoral quanto no estroma associado ao tumor.
Um teste alternativo para quantificar e fenotípio populações de células imunes é a análise de citometria de fluxo, ou a citometria por análise de tempo de vôo (CyTOF), de amostras tumorais ou periféricas ( ou seja, sangue ou ascite). Usando issoTécnica, todas as informações sobre localização e distribuição relativa dos diferentes tipos de células são perdidas. O uso e a análise de amostras periféricas também não fornecem informações sobre quais células podem infiltrar o microambiente do tumor. As análises de células imunitárias de sangue e ascite demonstraram não refletir o fenótipo e a freqüência de infiltração de células imunes do tecido tumoral 8 , 9 .
Outra alternativa é o uso de microscopia de campo brilhante. Uma vantagem desta técnica em relação à imagem de fluorescência é a ausência de autofluorescência de tecido. Embora algumas amostras contenham mais autofluorescência – particularmente eritrócitos, mas também outros tipos de células, incluindo granulócitos neutrofílicos – essas áreas podem ser facilmente removidas na análise de quase todas as amostras. A imunofluorescência oferece a vantagem de analisar marcadores múltiplos em uma amostra usando um painel de fluorescência específicaNt wavelengths. Isto é actualmente impossível na mesma medida para o microscópio de campo brilhante devido à falta de um número suficiente de rótulos e isotipos de anticorpos comercialmente disponíveis para um antígeno particular.
A técnica de fluorescência multicolor de IHC descrita aqui foi utilizada em vários tipos diferentes de câncer e combinações de anticorpos para estudar diferentes populações de células imunes, bem como moléculas expressas por células tumorais, tais como antígenos de leucócitos humanos (HLA) e PD-L1 10 , 11 , 12 . O protocolo foi estabelecido e validado utilizando vários tipos diferentes de amostras e anticorpos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para o protocolo descrito, uma das etapas mais críticas é determinar a diluição correta dos anticorpos primários utilizados. A diluição dos anticorpos secundários marcados foi de 1: 200, conforme recomendado pelo fabricante desses anticorpos específicos marcados com Alexa. A diluição dos anticorpos primários deve então ser determinada por uma diluição em série, de preferência usando duas amostras diferentes do tipo de tecido pretendido (neste caso, OPSCC). A diluição de trabalho ideal é a diluição …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Simone Punt foi apoiada pela concessão UL2010-4801 da Dutch Cancer Society. Gostaríamos de agradecer a todos os co-autores do artigo original que este protocolo JoVE se baseia: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter e Sjoerd van Der Burg.
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
Referências
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