Fyra färgfluorescensimmunohistokemi av T-cell-subpopuleringar i Archival Formalin-fixade, paraffin-inbäddade humana orofaryngeala Squamous Cell Carcinomprover
Summary
Multiparameterfluorescensimmunhistokemi kan användas för att bedöma antalet, relativ fördelning och lokalisering av immuncellpopulationer i tumörmikromiljö. Detta manuskript beskriver användningen av denna teknik för att analysera T-cell subpopulationer i orofaryngealkreft.
Abstract
Den fyrafärgade fluorescensimmunhistokemitekniken (IHC) -tekniken är en metod för att kvantifiera cellpopulationer av intresse med beaktande av deras relativa fördelning och lokalisering i vävnaden. Denna teknik har applicerats i stor utsträckning för att studera immuninfiltratet i olika tumortyper. Tumörmiljömiljön infiltreras av immunceller som lockas till tumörplatsen. Olika immuncellpopulationer har visat sig spela olika roller i tumörmiljömiljön och att ha en annan inverkan på sjukdomsutfallet. Detta manuskript beskriver användningen av multiparameterfluorescens IHC på orofarynge-plättcellcellkarcinom (OPSCC) som ett exempel. Denna teknik kan utvidgas till andra vävnadsprover och celltyper av intresse. I den presenterade studien analyserade vi det intraepiteliala och stromala facket i en stor OPSCC-kohort (n = 162). Vi fokuserade på totala T-lymfocyter (CD3 + ), immunosuppressiva regulatOry-T-celler (Tregs, dvs FoxP3 + ) och T helper 17 (Th17) -celler ( dvs. IL-17 + CD3 + ) med användning av ett nukleärt motstånd för att skilja tumörepitel från stroma. Ett stort antal T-celler befanns vara korrelerade med förbättrad sjukdomsfri överlevnad hos patienter med ett lågt antal intratumorala IL-17 + icke-T-celler. Detta föreslår att IL-17 + icke-T-celler kan korreleras med ett dåligt immunsvar i OPSCC, vilket överensstämmer med korrelationen som beskrivs mellan IL-17 och dålig överlevnad hos cancerpatienter. För närvarande utvecklas nya multiparameterfluorescens IHC-tekniker med upp till 7 olika fluorokrom och möjliggör en mer exakt karakterisering och lokalisering av immunceller i tumörmikro-miljön.
Introduction
Oropharyngeal squamous cell carcinom (OPSCCs) är en heterogen grupp av skivkörtelcancercancer med ursprung i orofarynxen. Riskfaktorer för OPSCC inkluderar humant papillomavirus (HPV) infektion och alkohol- och tobaksbruk 1 , 2 . Immunsvarets roll och hur man använder det i en klinisk miljö börjar bara undersökas. Tumörmiljömiljön infiltreras av immunceller som lockas till cancerplatsen. Fastän en hög CD8 + cytotoxisk T-cellfrekvens har korrelerats med förbättrad överlevnad hos OPSCC-patienter 3 , är rollen för andra T-cellsubsatser, inklusive Tregs och Th17-celler, fortfarande oklart 4 . Medan Th1 och Th17-celler är avsedda att hjälpa till i immunresponsmålande tumörceller är Tregs välkända för deras förmåga att undertrycka aktiviteten hos andra T-celler 5 . Men närvaron av TRegs har visat sig korrelera med både gynnsamma och ogynnsamma svar i olika tumortyper 6 . Eftersom inte alla immunceller som är närvarande i blodet infiltrerar tumören i samma utsträckning, tillhandahåller den lokala tumörmikromiljön den mest tillförlitliga åtgärden av immunsvaret riktat mot tumören. Syftet med denna studie är att bestämma korrelationen mellan antal och typer av immunceller och det kliniska resultatet. Vi använde fyrfärgsfluorescens IHC-bildbehandling för att analysera antal och lokalisering av olika T-cell-subpopulationer i humant OPSCC.
Vi fokuserade på totala T-lymfocyter (CD3 + ), Th17-celler och immunosuppressiva FoxP3 + Tregs, vars differentieringsväg är nära besläktad med Th17-celler. Th17-celler kännetecknas av kombinationen av CD3 och IL-17. Cytokinet IL-17 kan också produceras av icke-T-celler 7 . Vi bestämde fördelningen av intraepitHelial och strom T-celler, Tregs, Th17 och IL-17 + icke-T-celler i en stor serie OPSCC-fall och analyserade korrelationerna med patientöverlevnad. Multicolor fluorescens IHC användes för att identifiera uttrycket av CD3, Foxp3 och IL-17 i kombination med ett DAPI-motstånd. Denna analys möjliggjorde enkel och tydlig identifiering av båda tumörcellerna (med användning av DAPI-nukleär färgning) och infiltrerande T-cellpopulationer (med användning av en kombination av olika markörer). Efter provberedning och färgning användes ett fluorescerande mikroskop och bildhanteringsprogram för att skilja de olika fluorescerande färgerna som användes och för att bestämma antalet och typen av celler som finns närvarande i både tumörepitelet och det tumörassocierade stromen.
En alternativ analys för att kvantifiera och fenotypa immuncellpopulationer är flödescytometrianalys eller cytometri vid tidpunkt för flygning (CyTOF) -analys av tumör eller perifera prov ( dvs. blod eller ascites). Använda dettaTeknik, förloras all information om lokalisering och relativ fördelning av de olika celltyperna. Användningen och analysen av perifera prover ger inte heller information om vilka celler som kan infiltrera tumörmiljömiljön. Blod- och asciteimmun-cellanalyser har visat sig inte återspegla fenotypen och frekvensen av immuncellinfiltrering av tumörvävnaden 8 , 9 .
Ett annat alternativ är användningen av ljusfältmikroskopi. En fördel med denna teknik över fluorescensavbildning är avsaknaden av vävnadsautofluorescens. Även om vissa prover innehåller mer autofluorescens, särskilt erytrocyter, men även andra celltyper, inklusive neutrofila granulocyter, kan dessa områden lätt avlägsnas i analysen av nästan alla prover. Immunofluorescens erbjuder fördelen att analysera flera markörer i ett prov genom att använda en panel med målinriktad fluoresceNt våglängder. Detta är för närvarande omöjligt i samma utsträckning för ljusfältmikroskopi på grund av bristen på ett tillräckligt antal etiketter och kommersiellt tillgängliga antikroppsisotyper för ett visst antigen.
Den mångfärgade fluorescens IHC-tekniken som beskrivits här har använts i många olika cancertyper och antikroppskombinationer för att studera olika immuncellpopulationer, liksom tumörcellsuttryckta molekyler, såsom humana leukocytantigener (HLA) och PD-L1 10 , 11 , 12 . Protokollet har upprättats och validerats med många olika typer av prover och antikroppar.
Protocol
Representative Results
Discussion
För det beskrivna protokollet är ett av de mest kritiska stegen att bestämma den korrekta utspädningen av de använda primära antikropparna. Utspädningen av de märkta sekundära antikropparna var 1: 200, såsom rekommenderas av tillverkaren av dessa specifika Alexa-märkta antikroppar. Spädningen av de primära antikropparna bör sedan bestämmas genom en seriell utspädning, företrädesvis med användning av två olika prover av den avsedda vävnadstypen (i detta fall OPSCC). Den optimala arbetsspädningen är…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Simone Punt stöddes av UL2010-4801 från det nederländska cancerförbundet. Vi vill tacka alla medförfattare till det ursprungliga pappret som detta JoVE-protokoll bygger på: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter och Sjoerd van Der Burg.
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
Referências
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?. Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?. Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. . Essential Medical Statistics. , (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. . Survival Analysis: A Self-Learning Text. , (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
