Chirurgical Ablation Essai pour étude de la régénération des yeux dans planaires

Summary

Ce protocole montre comment exciser constamment les yeux planaires (tasses optiques) sans déranger les tissus environnants. En utilisant une aiguille d'insuline et d'une seringue, un ou les deux yeux peuvent être ablatée pour faciliter les enquêtes sur les mécanismes de régulation de la régénération des yeux, l'évolution de la régénération visuelle, et les bases neurales du comportement induite par la lumière.

Abstract

Dans l'étude des cellules souches adultes et les mécanismes de régénération, flatworms planaires sont un aliment de base dans le système modèle in vivo. Cela est dû en grande partie à leur population de cellules souches pluripotentes abondante et la capacité de régénérer tous les types de cellules et de tissus après des blessures qui seraient catastrophiques pour la plupart des animaux. Récemment, planaires ont gagné en popularité en tant que modèle pour la régénération des yeux. Leur capacité à régénérer l'œil entier (comprenant deux types de tissus: cellules de pigment et photorécepteurs) permet la dissection des mécanismes de régulation de la régénération du système visuel. L'ablation des yeux présente plusieurs avantages par rapport aux autres techniques (telles que la décapitation ou perforatrice) pour l'examen des voies spécifiques à l'oeil et les mécanismes, dont le plus important est que la régénération est en grande partie limitée aux tissus oculaires seuls. Le but de cet article vidéo est de montrer comment supprimer de manière fiable la coupe optique planaires sans perturber le cerveau ou les tissus environnants.La manipulation des vers et à l'entretien d'une colonie établie est également décrite. Cette technique utilise un 31 G, 5 / aiguille d'insuline de 16 pouces pour ramasser une intervention chirurgicale sur la coupe optique planaires de immobilisées sur une plaque froide. Cette méthode englobe à la fois l'ablation oculaire simple et double, avec les yeux régénérant dans les 1-2 semaines, ce qui permet un large éventail d'applications. cette technique d'ablation en particulier, peut être facilement combiné avec des écrans pharmacologiques et génétiques (interférence ARN) pour une meilleure compréhension des mécanismes de régénération et de leur évolution, les cellules souches des yeux et leur entretien, et les réponses comportementales phototaxic et leur base neurologique.

Introduction

Planaires sont un organisme modèle puissant pour étudier la régénération des cellules à médiation souches adultes. Ces planaires d'eau douce non parasites possèdent la capacité de régénérer les tissus et tous les disparus, y compris leur système nerveux central et le cerveau ^1. Étudié dès les années 1700 ^2, les avancées technologiques dans le domaine planaire au cours des 10-15 dernières années ( par exemple un génome séquencé, l'hybridation in situ, l' immunohistochimie, l' interférence ARN (ARNi), et transcriptomique) ont mis à jour cet organisme modèle historique . Plus précisément, les planaires ont récemment gagné en popularité comme un nouveau modèle pour la recherche des yeux ^3.

Planaires ont des yeux prototypiques avec seulement deux types de tissus, les neurones photorécepteurs et des cellules de pigment; ce qui a permis la caractérisation de la population oeil sur les cellules souches et a démontré que la plupart des mêmes gènes de régulation de l'oeil de vertébrésveloppement sont conservés dans planaires ^{4, 5.} Les coupes optiques sont situés dorsalement et comprennent des dendrites blanches, non pigmentés des neurones photorécepteurs et les cellules de pigment noir semi-lunaires, et les yeux innervent le cerveau par l'intermédiaire d'un chiasma optique. En plus d'être un modèle pour élucider les processus de régénération ^6, l'oeil planaire est bien adaptée à l' étude de l'évolution des mécanismes visuels ^7, les réponses comportementales à la lumière (planaires afficher phototaxie négative) ^8, et la base du comportement neurologique ^9.

La régénération des yeux dans planaires a été largement étudié dans deux contextes principaux: dans le cadre de la régénération de la tête suivante ^{4 décapitation, 10,} et après l' excision de seulement les tissus oculaires ^{11, 12} </sup>. La plupart des études planaires sur la régénération des yeux ont utilisé la méthode de la décapitation, car il est simple et direct. La méthode la plus courante de l' excision des yeux planarian à ce jour a été par perforatrice avec un beau tube capillaire en verre ^{13, 14,} bien que certaines études ont également effectué des amputations juste derrière les yeux (décapitation partielle) ^15. Cependant, toutes ces méthodes impliquent la perte de nombreux tissus autres que de l'œil (comme le cerveau, les intestins, et néphridies), ce qui complique l'interprétation des résultats potentiellement. Le protocole d'ablation oculaire présenté ici limite l'excision des tissus oculaires (en particulier à l'exclusion du cerveau), entraînant des données plus spécifiques à l'œil. De plus, à la différence des vers décapités qui prennent 7-14 jours pour commencer l' alimentation, les yeux vers ablatée alimenteront dans les 24 h d'ablation ^12, ce qui permet des expériences ARNi (où l' ARNi est délivré par la nourriture) à performeD simultanément.

Bien que l'ablation de l'oeil est techniquement plus difficile à réaliser avec succès que la décapitation, les études en cours portant sur l'excision des yeux ne sont pas inclus des instructions détaillées sur leurs procédures. L'objectif de cet article vidéo est de permettre aux chercheurs d'enlever systématiquement la coupe optique planaires sans perturber les tissus cérébraux sous-jacents et la suppression de quelques autres tissus que possible. Cette méthode peut être utilisée à la fois l'ablation oculaire simple et double et est applicable à un large éventail d'enquêtes. Comme la plupart des essais de régénération, l'ablation de l'œil est bien adapté pour une combinaison avec les deux écrans (ARNi) pharmacologiques et génétiques, ainsi que des études comportementales. Nous décrivons ici les méthodes pour la manipulation des vers, en maintenant une colonie planaires, et la technique d'ablation de l'œil lui-même.

Protocol

1. Culture des animaux et la manipulation NOTE: Ce protocole utilise mediterranea Schmidtea, une espèce planaires diploïdes avec un génome séquencé 16, 17 qui est couramment utilisé pour la recherche sur la régénération. Cependant, le dosage est le même succès avec d' autres espèces, telles que Girardia Tigrina et Girardia dorotocephala (qui sont disponibles dans le commerce). <st…

Representative Results

Pour la première 1-2 h après la chirurgie, les animaux peuvent présenter un mouvement diminué par rapport aux vers intacts (mais ils se déplaceront encore). Si vous le souhaitez, les vers mangent dans les 24 h de la chirurgie (par exemple, pour l'alimentation ARNi). En suivant la régénération des yeux chez les mêmes personnes au fil du temps, assurez-vous de prendre une photo de chaque ver à la fois avant la chirurgie (intacte) et à 1 h ablation post (hpa). En 4 jours apr?…

Discussion

Cette technique d'ablation de l'oeil améliore les méthodes actuelles (comme perforatrice) en excluant les tissus du cerveau et en limitant l'excision principalement aux tissus oculaires. Avec la pratique, cette technique peut être réalisée par la plupart des individus, des techniciens expérimentés dans microchirurgies aux étudiants de premier cycle inexpérimentés mais consciencieux. Il est recommandé que cette technique soit pratiquée plusieurs fois avant d'utiliser ablations dans des expéri…

Materials

Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional