אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

Summary

פרוטוקול זה מראה כיצד שיחתוך עיני planarian בעקביות (כוסות אופטיות) מבלי להפריע רקמות סובבות. באמצעות מחט אינסולין במזרק, או אחת או בשתי העיניים יכול להיות מלוטשים על מנת להקל על חקירת מנגנוני ויסות התחדשות העין, את האבולוציה של התחדשות ויזואלית, ואת הבסיס העצבי של התנהגות האור המושרה.

Abstract

במחקר של תאי גזע בוגרים ומנגנונים רגנרטיבית, תולעים שטוחות planarian הן מצרך במערכת מודל vivo. הדבר נובע במידה רבה האוכלוסייה ויכולת תאי גזע פלוריפוטנטיים בשפע שלהם כדי להתחדש כל סוגי תאים ורקמות לאחר פציעות כי יהיה קטסטרופלי עבור רוב החיות. לאחרונה, planarians זכה לפופולריות כמודל התחדשות עין. היכולת שלהם להתחדש העין כולה (המורכב משני סוגי רקמות: תאי פיגמנט קולטני האור) מאפשר דיסקציה של מנגנוני ויסות התחדשות מערכת הראייה. יש עיניים אבלציה מספר יתרונות על פני שיטות אחרות (כמו עריפת ראש או ניקוב חורים) לבחינת מסלולים ספציפיים העין ומנגנונים, שהחשוב בהם הוא התחדשות התאים היא מוגבלת בעיקר ברקמות העין לבד. מטרת מאמר זה וידאו היא להדגים כיצד להסיר את הכוס האופטית planarian מהימנה מבלי להפריע למוח או רקמות סובבות.טיפול תולעים והתחזוקה של מושבה הוקמה מתואר גם. טכניקה זו משתמשת 31 G, 5/16-inch מחט אינסולין כדי בניתוח לגרוף את הכוס האופטית של planarians משותקת על צלחת קרה. שיטה זו כוללת הן אבלציה עין אחת כפולה, בעיניים התחדשות בתוך 1-2 שבועות, המאפשר מגוון רחב של יישומים. בפרט, בטכניקה זו אבלציה ניתן לשלב בקלות עם מסך (התערבות RNA) תרופתי וגנטי עבור הבנה טובה יותר של מנגנון שיקום וההתפתחות שלהם, תאי גזע עין והתחזוקה שלהם, ותגובות התנהגותיות phototaxic ואת הבסיס הנוירולוגי שלהם.

Introduction

Planarians הם אורגניזם מודל עוצמה לחקר התחדשות גזע בוגרים בתיווך התא. Flatworms המתוק שאינו טפיל אלה להחזיק את היכולת להתחדש כל וכל רקמות חסרות, כוללים מערכת המוח ¹ העצבים המרכזיים שלהם. למד לאחור ככל ה -1700 ^2, ההתקדמות הטכנולוגית בתחום planarian במהלך 10-15 השנים האחרונות (כגון הגנום רצף, הכלאה באתרו, אימונוהיסטוכימיה, התערבות RNA (RNAi), ו transcriptomics) עדכנת אורגניזם מודל היסטורי זה . באופן ספציפי, planarians צבר פופולריות לאחרונה כמודל המתעורר למחקר עין ^3.

יש Planarians עיניים אב-טיפוס עם רק שני סוגי רקמות, הנוירונים קולטי האור ותאי הפיגמנט; זו אפשרה את האפיון של האוכלוסייה בתאי גזע העין שלו והוכיח כי רבים מן הגנים באותו ויסות דה העין החולייתניםvelopment שמורה ב planarians ^{4, 5.} הכוסות האופטיות ממוקמות dorsally ובהשתתפות הדנדריטים הלבן, חסר הצבע של נוירונים קולטי האור ואת תאי הפיגמנט שחור למחצה ירחיים, והעיניים המעצבבות את המוח באמצעות תצלובת ראייה. בנוסף להיות מודל הבהרת תהליכי התחדשות ^6, עין planarian היא גם מתאימה ללימוד האבולוציה של מנגנוני ויזואלית ^7, תגובות התנהגותיות אור (planarians להציג phototaxis השלילית) ^8, ואת הבסיס הנוירולוגי של התנהגות ^9.

התחדשות Eye ב planarians נחקרה בעיקר בשני הקשרים עיקריים: כחלק התחדשות הראש בעקבות עריפת ^{4, 10,} ובעקבות כריתה של ממש ברקמות העין ^{11, 12} </sup>. רוב מחקרי planarian על התחדשות עין השתמשו בשיטת עריפת הראש, כפי שהוא הוא פשוט וברור. שיטת כריתת עין planarian הנפוצה ביותר עד כה הייתה באמצעות ניקוב חורים עם צינור נימי זכוכית עדינה ^{13, 14,} אם כי מחקרים מסוימים גם בצעו קטיעות ממש מאחורי העיניים (עריפה חלקית) ^15. עם זאת, כל השיטות הללו כרוכות באובדן רב ברקמות אחרות מאשר רק את העין (כגון מוח, מעיים, ואת nephridia), פוטנציאל סיבוך פרשנות של תוצאות. פרוטוקול אבלציה העין המוצג כאן מגביל כריתה לרקמות העין (למעט במפורש המוח), וכתוצאה מכך נתונים ספציפיים יותר לעין. בנוסף, בניגוד תולעים ערופות כי לקחת 7-14 ימים כדי להתחיל האכלה, תולעי ablated עין יאכילו בתוך 24 שעות של אבלציה ^12, המאפשרים ניסויי RNAi (שם RNAi מועבר באמצעות מזון) כדי להיות performed במקביל.

למרות אבלציה עין היא קשה מבחינה טכנית לבצע בהצלחה מ עריפת הראש, המחקרים נוכחיים המעורבים כריתת עין לא כללו הוראות מפורטות לגבי הנהלים שלהם. מטרת מאמר זה וידאו היא לאפשר לחוקרים להסיר את הכוס האופטית planarian בעקביות מבלי להפריע רקמות המוח הבסיסיות וסרים כמו כמה רקמות אחרות ככל האפשר. שיטה זו יכולה לשמש הן אבלציה עין אחת כפולה והוא ישים למגוון רחב של חקירות. כמו רוב מבחני התחדשות, אבלציה עין מתאימה גם עבור שילוב עם שתי תרופתי וגנטי (RNAi) מסך, כמו גם מחקרים התנהגותיים. כאן אנו מתארים שיטות לטיפול תולעים, שמירה על מושבת planarian, ואת טכניקת אבלציה העין עצם.

Protocol

1. התרבות טיפול בבעלי חיים הערה: פרוטוקול זה משתמש Schmidtea Mediterranea, זן planarian דיפלואידי עם הגנום רצף 16, 17, כי הוא נפוץ למחקר התחדשות. עם זאת, assay הוא פחות מוצלח עם מינים אחרים, כגון Girardia tigrina ו Girardi…

Representative Results

עבור ניתוח 1-2 שעות לאחר הראשונה, חיות עשויות להפגין ירידה בתנועה לעומת תולעים שלמים (אולם הם עדיין יעברו). אם תרצה, תולעים יאכלו בתוך 24 שעות של ניתוח (למשל, עבור האכלת RNAi). כאשר בעקבות התחדשות עין באותו אנשים לאורך זמן, הקפד לצלם כל תולעת הן לפני הניתוח (…

Discussion

טכניקת עין אבלציה זה משפרת על השיטות הקיימות (כגון ניקוב חורים) על ידי לא כולל רקמות המוח הגבלה כריתה בעיקר ברקמות העין. בעזרת תרגול, טכניקה זו יכולה להתבצע על ידי רוב האנשים, מטכנאים מנוסים microsurgeries לסטודנטים לתואר ראשונים מנוסים אבל מצפון. מומלץ כי הטכניקה הזו להיות ?…

Materials

Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional