Planarians में नेत्र पुनर्जनन अध्ययन के लिए सर्जिकल एबलेशन परख

Summary

यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे लगातार आसपास के ऊतकों को परेशान किए बिना planarian आँखें (ऑप्टिक कप) उत्पाद शुल्क के लिए। एक इंसुलिन सुई और सिरिंज, या तो एक का उपयोग करना या दोनों आँखों तंत्र आंख उत्थान, दृश्य उत्थान के विकास, और प्रकाश प्रेरित व्यवहार के तंत्रिका आधार को विनियमित करने की जांच की सुविधा के लिए ablated जा सकता है।

Abstract

वयस्क स्टेम सेल और पुनर्योजी तंत्र के अध्ययन में, planarian चपटे कृमि विवो मॉडल प्रणाली में एक प्रधान है। यह उनकी प्रचुर मात्रा में स्टेम सेल आबादी और चोटों कि ज्यादातर जानवरों के लिए घातक हो सकता है के बाद सभी सेल और ऊतक प्रकार पुनर्जीवित करने की क्षमता के लिए बड़े हिस्से में कारण है। हाल ही में, planarians आंख उत्थान के लिए एक मॉडल के रूप में लोकप्रियता हासिल की है। उनके (दो ऊतक प्रकार के शामिल: रंगद्रव्य कोशिकाओं और फोटोरिसेप्टर) पूरे आंख पुनर्जीवित करने की क्षमता तंत्र दृश्य प्रणाली उत्थान को विनियमित करने के विच्छेदन के लिए अनुमति देता है। नेत्र पृथक आंख को विशिष्ट रास्ते और तंत्र, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण है कि उत्थान काफी हद तक अकेले आंख ऊतकों तक ही सीमित है की जांच के लिए (जैसे कि कत्ल या छेद पंच के रूप में) अन्य तकनीकों पर कई फायदे हैं। इस वीडियो लेख के उद्देश्य मज़बूती से मस्तिष्क को परेशान करने या ऊतकों आसपास के बिना planarian ऑप्टिक कप को निकालने का तरीका प्रदर्शित करने के लिए है।कीड़े और एक स्थापित कॉलोनी के रखरखाव की हैंडलिंग भी वर्णन किया गया है। इस तकनीक को एक 31 जी, 5/16-inch इंसुलिन सुई का उपयोग करता है शल्य चिकित्सा द्वारा एक ठंडा थाली पर स्थिर planarians की ऑप्टिक कप से बाहर निकालना है। इस विधि दोनों सिंगल और डबल आंख पृथक शामिल हैं, 1-2 सप्ताह में पुनः आँखों से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, इस पृथक तकनीक आसानी से पुनर्योजी तंत्र और उनके विकास, आंख स्टेम कोशिकाओं और उनके रखरखाव, और phototaxic व्यवहार प्रतिक्रियाओं और उनके मस्तिष्क संबंधी आधार का एक बेहतर समझ के लिए औषधीय और आनुवंशिक (आरएनए हस्तक्षेप) स्क्रीन के साथ जोड़ा जा सकता है।

Introduction

Planarians वयस्क स्टेम सेल की मध्यस्थता उत्थान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव हैं। इन गैर-परजीवी मीठे पानी चपटे कृमि उनके केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और मस्तिष्क ¹ सहित किसी भी और सभी लापता ऊतकों, पुनर्जीवित करने की क्षमता होती है। (स्वस्थानी संकरण, इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई), और transcriptomics में इस तरह के एक अनुक्रम जीनोम के रूप में,) रूप में वापस दूर 1700 के दशक ^2, तकनीकी पिछले 10-15 वर्षों के दौरान planarian क्षेत्र के क्षेत्र में प्रगति के रूप में अध्ययन इस ऐतिहासिक मॉडल जीव को अद्यतन किया है । विशेष रूप से, planarians हाल ही में आंख अनुसंधान ³ के लिए एक उभरती हुई मॉडल के रूप में लोकप्रियता हासिल की है।

Planarians केवल दो ऊतक प्रकार, फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स और वर्णक कोशिकाओं के साथ prototypic आँखें है; यह अपने आंख स्टेम कोशिका आबादी के लक्षण वर्णन सक्षम और प्रदर्शन एक ही जीन के कई को विनियमित कि हड्डीवाला आंख डे हैvelopment planarians ^{4, 5} में संरक्षित कर रहे हैं। ऑप्टिक कप पृष्ठीय रूप में स्थित हैं और अर्द्ध चंद्र काले रंग की कोशिकाओं फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स की सफेद, unpigmented डेन्ड्राइट और के शामिल, और आँखें एक ऑप्टिक व्यत्यासिका के माध्यम से मस्तिष्क के अंदर आना। पुनर्योजी प्रक्रियाओं का वर्णन ⁶ के लिए एक मॉडल होने के अलावा, planarian आंख अच्छी तरह से दृश्य तंत्र ⁷ के विकास के अध्ययन के लिए अनुकूल है, व्यवहार प्रतिक्रियाओं प्रकाश में ^8, और व्यवहार ⁹ के तंत्रिका विज्ञान के आधार पर (planarians नकारात्मक phototaxis दिखाते हैं)।

Planarians में नेत्र उत्थान काफी हद तक दो मुख्य संदर्भों में अध्ययन किया गया है: सिर उत्थान के हिस्से के रूप में निम्नलिखित कत्ल ^{4, 10,} और सिर्फ आंख ऊतकों ¹¹ के छांटना के ^{बाद, 12} </sup>। आंख उत्थान पर अधिकांश planarian अध्ययन, कत्ल विधि का इस्तेमाल किया है के रूप में यह सरल और सीधा है। आज तक का सबसे आम planarian आंख छांटना विधि, एक ठीक गिलास केशिका ट्यूब ^{13, 14} के साथ छेद पंच के माध्यम से किया गया है हालांकि कुछ अध्ययनों भी सिर्फ आँखों (आंशिक कत्ल) ¹⁵ के पीछे अंगविच्छेद जैसी शल्यक्रियाओं प्रदर्शन किया है। हालांकि, इन सभी विधियों कई सिर्फ आंख के अलावा अन्य (जैसे मस्तिष्क, आंतों, और nephridia के रूप में) के ऊतकों के नुकसान शामिल, संभावित परिणामों का विश्लेषण उलझी। आंख पृथक यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल आंख ऊतकों (विशेष रूप से मस्तिष्क को छोड़कर), डेटा में जिसके परिणामस्वरूप है कि आंखों के लिए अधिक विशिष्ट हैं करने के लिए काटना प्रतिबंधित करता है। साथ ही, उसका सिर धड से कीड़े कि 7-14 दिन लग खिला शुरू करने के विपरीत, आंख ablated कीड़े पृथक ¹² के 24 घंटे के भीतर फीड होगा, आरएनएआई प्रयोगों (जहां आरएनएआई भोजन के माध्यम से वितरित किया जाता है) की अनुमति के performe जा करने के लिएसमवर्ती डी।

हालांकि आंख पृथक तकनीकी रूप से कठिन सफलतापूर्वक कत्ल से प्रदर्शन करने के लिए है, वर्तमान आंख छांटना शामिल पढ़ाई उनकी प्रक्रियाओं पर विस्तृत निर्देश शामिल नहीं किया है। इस वीडियो लेख के लक्ष्य को लगातार अंतर्निहित मस्तिष्क के ऊतकों को परेशान करने और संभव के रूप में कुछ अन्य ऊतकों को हटाने के बिना planarian ऑप्टिक कप दूर करने के लिए शोधकर्ताओं सक्षम बनाना है। इस विधि दोनों सिंगल और डबल आंख पृथक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता और जांच की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है। सबसे उत्थान assays की तरह, आंख पृथक अच्छी तरह से दोनों औषधीय और आनुवंशिक (आरएनएआई) स्क्रीन, साथ ही व्यवहार अध्ययन के साथ संयोजन के लिए उपयुक्त है। यहाँ हम कीड़े की हैंडलिंग के लिए तरीके का वर्णन है, एक planarian कॉलोनी को बनाए रखने, और आंख पृथक तकनीक ही।

Protocol

1. पशु संस्कृति और हैंडलिंग नोट: यह प्रोटोकॉल Schmidtea मेडिटेरेनिया, एक अनुक्रम जीनोम 16, 17 है जो सामान्यतः उत्थान अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ एक द्विगुणित planari…

Representative Results

पहले 1-2 घंटे के बाद सर्जरी के लिए, जानवरों बरकरार कीड़े (हालांकि वे अभी भी आ जाएगा) की तुलना में कमी आई आंदोलन प्रदर्शन कर सकते हैं। अगर वांछित, कीड़े सर्जरी के 24 घंटे के भीतर (उदाहरण के लिए, आरए?…

Discussion

यह आंख पृथक तकनीक मस्तिष्क के ऊतकों को छोड़कर और आंख के ऊतकों को मुख्य रूप से छांटना सीमित करके (जैसे छेद पंच के रूप में) वर्तमान तरीकों पर बेहतर बनाता है। अभ्यास के साथ, इस तकनीक, सबसे अधिक व्यक्तियों द्?…

Materials

Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional