Kirurgisk ablasjon analyse for å studere Eye Regeneration i Planarians

Summary

Denne protokollen viser hvordan man konsekvent skjære planarian øyne (optiske kopper) uten å forstyrre omkringliggende vev. Ved hjelp av en insulin nål og sprøyte enten ett eller begge øyne kan ablateres for å lette undersøkelser av de mekanismer som regulerer øye regenerering, utviklingen av visuelle regenerering, og den nevrale grunnlaget for lys-indusert adferd.

Abstract

I studiet av voksne stamceller og regenerative mekanismer, planarian flatormer er en stift in vivo-modellsystem. Dette skyldes i stor grad til deres rike pluripotent stamcellepopulasjon og evne til å regenerere alle celle og vevstyper etter skader som ville være katastrofalt for de fleste dyr. Nylig har planarians vunnet popularitet som en modell for øye regenerering. Deres evne til å regenerere hele øyet (bestående av to vevstyper: pigmentceller og fotoreseptorer) gjør det mulig for disseksjon av de mekanismer som regulerer synssystemet regenerering. Eye ablasjon har flere fordeler i forhold til andre teknikker (slik som halshugging eller hullemaskin) for undersøkelse av øye-spesifikke veier og mekanismer, den viktigste av hvilke er at regenerering er i stor grad begrenset til øyevev alene. Hensikten med denne video artikkelen er å vise hvordan man kan fjerne en pålitelig måte den planarian optiske koppen uten å forstyrre hjernen eller omgivende vev.Håndteringen av ormer og vedlikehold av en etablert koloni er også beskrevet. Denne teknikken bruker en 31 g, 5/16-inch insulin nål kirurgisk å øse ut den optiske kopp planarians immobilisert på en kald plate. Denne metode omfatter både enkelt- og dobbelt øye ablasjon, med øyne regenererende løpet av 1-2 uker, noe som åpner for et bredt spekter av applikasjoner. Spesielt kan denne ablasjon teknikken enkelt kombineres med farmakologiske og genetiske (RNA interferens) skjermer for en bedre forståelse av regenerative mekanismer og deres utvikling, øye stamceller og deres vedlikehold, og phototaxic atferdsmessige reaksjoner og deres nevrologiske basis.

Introduction

Planarians er en kraftig modellorganisme for å studere voksen stamcelle-mediert regenerering. Disse ikke-parasittiske ferskvann flatormer har evnen til å regenerere seg alle manglende vev, inkludert deres sentralnervesystemet og hjerne ^1. Studert så langt tilbake som 1700-tallet ^2, teknologiske fremskritt i planarian felt i løpet av de siste 10-15 årene (for eksempel en sekvens genom, in situ hybridisering, immunhistokjemi, RNA-interferens (RNAi), og transcriptomics) har oppdatert den historiske modellorganisme . Spesielt planarians har nylig vunnet popularitet som en ny modell for øyet forskning ^tre.

Planarians har prototypic grundig med bare to vevstyper, fotoreseptoren nevroner og pigmentceller; Dette har gjort det mulig å karakterisere dens øye stilk-cellepopulasjon og vist at mange av de samme genene som regulerer vertebrate øye degen er konservert i planarians ^{4, 5.} De optiske koppene er lokalisert dorsalt og består av de hvite, pigmenterte dendritter av fotoreseptoren nevroner og de halvmåne svart pigmentceller, og øynene innerverer hjernen via en optisk chiasm. I tillegg til å være en modell for å belyse regenerative prosesser ^6, er det planarian øyet godt egnet for å studere utviklingen av visuelle mekanismer ^7, adferdsmessige responser overfor lys (planarians vise negativ phototaxis) ^8, og den nevrologiske basis av opptreden ^9.

Eye regenerering i planarians stor grad har vært studert i to hoved sammenhenger: som en del av hode-regenerering etter halshugging, ^{4, 10,} og etter fjerning av kun de øyevev ^{11, 12} </sup>. De fleste planarian studier på øyet regenerering har brukt halshogging metoden, som det er enkelt og ukomplisert. Den vanligste planarian øye eksisjon metode hittil har vært via hullemaskin med et fint glass kapillarrør ^{13, 14,} selv om noen studier har også utført amputasjoner like bak øynene (partiell dekapitasjon) ^15. Imidlertid har alle disse metoder innebærer tap av mange andre faktorer enn bare øyet vev (for eksempel hjerne, tarm, og nephridia), potensielt kompliserer tolkningen av resultatene. Øyet ablasjon Protokollen som presenteres her begrenser eksisjon til øyet vev (spesielt med unntak av hjerne), noe som resulterer i data som er mer spesifikke for øyet. I tillegg, til forskjell fra de halshugde ormer som tar 7-14 dager for å begynne mating, vil øyet ablateres ormer mate innen 24 timer etter ablasjon ^12, slik at RNAi eksperimenter (hvor RNAi blir levert via mat) som skal performed samtidig.

Selv øye ablasjon er teknisk vanskeligere å lykkes utføre enn halshogging, har nåværende studier med eye excision ikke inkludert detaljerte instruksjoner om sine rutiner. Målet med denne videoen artikkelen er å muliggjøre forskere å konsekvent fjerne planarian optiske cup uten å forstyrre de underliggende hjernevev og fjerne så få andre vev som mulig. Denne fremgangsmåten kan brukes for både enkelt- og dobbelt øye ablasjon og er anvendelig for en lang rekke undersøkelser. Som de fleste restitusjon analyser, er øye ablasjon godt egnet for kombinasjon med både farmakologiske og genetiske (RNAi) skjermer, så vel som Adferdsstudier. Her beskriver vi metoder for håndtering av ormer, opprettholde en planarian koloni, og øyet ablasjon teknikk selv.

Protocol

1. Animal Kultur og håndtering MERK: Denne protokollen bruker Schmidtea mediterranea, en diploid planarian art med en sekvens genom 16, 17 som vanligvis brukes for regenerering forskning. Imidlertid er analysen like vellykket med andre arter, for eksempel Girardia tigrina og Girardia dorotocephala (som er kommersielt tilgjengelig). Oppretthold ormer i "orm vann", av 0,5 g / l s…

Representative Results

For det første 1-2 timer etter kirurgi, kan dyrene oppviser nedsatt bevegelse sammenlignet med intakte ormer (men de vil fortsatt bevege seg). Om ønskelig vil mark eter i løpet av 24 timer etter operasjonen (for eksempel, for RNAi mating). Når du følger øye regenerering i de samme individene over tid, sørg for å ta et bilde av hver ormen både før operasjonen (intakt) og en time etter ablasjon (HPA). Av 4 dager etter ablasjon (DPA) regenerering pigmentceller skal være synlig, o…

Discussion

Dette øyet ablasjon teknikk forbedrer på dagens metoder (for eksempel hulle) ved å ekskludere hjernevev og begrense eksisjon i hovedsak til den øyevev. Med praksis, kan denne teknikken utføres av de fleste individer, fra teknikere opplevde i microsurgeries til uerfarne men pliktoppfyllende studentene. Det anbefales at denne teknikken bli praktisert mange ganger før anvendelse ablations i eksperimenter, inklusive (hvis mulig) bekreftelse på fullstendig fjerning av alle øyevev ved immunhistokjemi eller in situ…

Materials

Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional