Хирургическая абляция Анализ для изучения Регенерации глаз в планарии

Summary

Этот протокол показывает, как последовательно акцизный планарии глаз (оптические чашки) без нарушения окружающих тканей. С помощью иглы и шприца инсулина, либо один или оба глаза могут быть абляции, чтобы облегчить расследование механизмов, регулирующих регенерацию глаз, эволюцию визуальной регенерации, а также нейронную основу светоиндуцированного поведения.

Abstract

В исследовании взрослых стволовых клеток и регенеративных механизмов, планарии плоских черви являются одним из основных продуктов в естественных условиях модельной системы. Это связано в значительной степени с их обильной плюрипотентных популяции стволовых клеток и способность к регенерации всех типов клеток и тканей после травм, которые были бы катастрофическими для большинства животных. В последнее время планарий завоевал популярность в качестве модели для регенерации глаз. Их способность к регенерации всему глаза (состоит из двух типов тканей: пигментные клетки и фоторецепторов) позволяет рассечения механизмов, регулирующих визуальную регенерации системы. Глаз абляция имеет несколько преимуществ по сравнению с другими методами (такими как обезглавливание или перфорация) для изучения глазных конкретных путей и механизмов, наиболее важными из которых является то, что регенерация в основном ограничиваются только тканями глаза. Цель этого видео статьи является показать, как надежно удалить планарии оптической чашки, не нарушая мозг или окружающие ткани.Обработка червей и поддержания установленной колонии также описана. Эта методика использует 31 г, 5/16-дюймовый инсулина иглы хирургическим путем выкопать оптический чашку планарий, иммобилизованных на холодную пластину. Этот метод включает в себя как одиночный и двойной абляции глаза, с глазами регенерирующих в течение 1-2 недель, что позволяет в широком диапазоне применений. В частности, этот метод абляции можно легко сочетать с фармакологическими и генетическими (РНК-интерференции) экраны для лучшего понимания регенеративных механизмов и их эволюции, стволовых клеток глаза и их содержание, а также phototaxic поведенческих реакций и их неврологической основе.

Introduction

Планарии являются мощным модельным организмом для изучения клеточной регенерации взрослых стволовых. Эти непаразитарных пресноводные плоские черви обладают способностью регенерировать любые и все недостающие ткани, в том числе их центральной нервной системы и головного мозга ^1. Училась еще в 1700 – х годах ^2, технологические достижения в области планарий в течение последних 10-15 лет (например, виртуализированного геном, гибридизация, иммуногистохимии, РНК – интерференции (иРНК), и транскриптомика в) обновили эту историческую модель организма , В частности, планарий недавно приобрел популярность в качестве новой модели для исследования глаза ^3.

Планарии имеют прототипический глаз только с двумя типов тканей, фоторецепторы нейронами и пигментными клетками; это позволило охарактеризовать ее глаз стволовых клеток населения и показал, что многие из тех же генов, регулирующих позвоночный глаз деvelopment сохраняются в планарии ^{4, 5.} Оптические чашки расположены дорсально и состоят из белых, окрашенных пигмента дендритов нейронов фоторецепторов и пол-лунным черного пигмента клеток, а глаза иннервируют мозг с помощью зрительного перекреста. Помимо того , что модель для выяснения регенеративных процессов ^6, планарии глаз хорошо подходят для изучения эволюции зрительных механизмов ^7, поведенческие реакции на свет (планарий отображать отрицательный фототаксис) ^8, и неврологическую основу поведения ^9.

Глаз в регенерации планарий была в значительной степени изучена в двух основных контекстах: в качестве части головки регенерации следуя обезглавливание ^{4, 10,} и после иссечения только тканей глаза ^{11, 12} </SUP>. Большинство планарий исследования по регенерации глаз использовали метод обезглавливание, как это просто и понятно. Наиболее распространенный метод планарии глаз иссечения до настоящего времени был через отверстие пуансон с тонким стеклянной капиллярной трубкой ^{13, 14,} хотя некоторые исследования также проводили ампутации только позади глаз (частичная декапитации) ^15. Тем не менее, все эти методы предполагают потерю многих других, чем просто глаз тканей (например, мозга, кишечника, и нефридиев), потенциально усложняет интерпретацию результатов. Протокол глаз абляции, представленный здесь ограничивает иссечение в ткани глаза (в частности, за исключением головного мозга), в результате чего данные, которые являются более специфическими для глаз. Кроме того, в отличие от обезглавленных червей , которые принимают 7-14 дней , чтобы начать кормление, глазные абляции черви будут кормить в течение 24 часов абляции ^12, что позволяет RNAi эксперименты (там , где иРНК доставляется через пищу) , чтобы быть performed одновременно.

Хотя глаз абляция технически сложнее, чтобы успешно выполнить, чем обезглавливание, в настоящее время исследования с участием глаз иссечение не включены подробные инструкции по их процедур. Цель этого видео статьи позволит исследователям, чтобы последовательно удалить планарии оптической чашки, не нарушая основные ткани мозга и удаления, как несколько других тканей, как это возможно. Этот метод может быть использован как для одиночного и двойного абляции глаза и применимо к широкому кругу исследований. Как и большинство анализов регенерации, глаза абляция хорошо подходят для комбинации с обеими фармакологическими и генетическими (RNAi) экранами, а также поведенческими исследованиями. Здесь мы опишем методы для обработки червей, поддерживая планарии колонию, а сама техника глаз абляции.

Protocol

1. Культура животных и регулировать Примечание: Этот протокол использует Schmidtea Mediterranea, диплоидные планарии видов с виртуализированным геномом 16, 17 , который обычно используются для исследования регенерации. Тем не менее, этот анализ в ?…

Representative Results

Для первой 1-2 ч после операции, животные могут обладать уменьшились движение по сравнению с интактными червями (однако, они все равно будут двигаться). При желании, черви будут есть в течение 24 часов после операции (например, для кормления RNAi). Когда после регенерации гл?…

Discussion

Эта техника глаза абляции улучшает современные методы (например, перфорация) путем исключения тканей мозга и ограничения иссечения в основном для тканей глаза. С практикой, эта техника может быть выполнена большинством людей, от опытных техников в микрохирургических для неопытных, но …

Materials

Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional