Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen.
Summary
Eine Methode, um Insektenzellen vorzubereiten und infizieren sie mit Baculovirus für die Zwecke der Produktion von rekombinanten mCD1d proteinand Erzeugung mCD1d Tetramere.
Abstract
CD1-Proteine bilden eine dritte Klasse von Antigen-präsentierenden Molekülen. Sie sind Zelloberfläche Glykoproteine, wie etwa 50-kDa glykosylierten schweren Ketten, die kovalent mit beta2-Mikroglobulin assoziiert sind Ausdruck. Sie binden Lipide als Peptide. Obwohl die Struktur bestätigt die Ähnlichkeit der CD1-Proteine auf MHC Klasse I und Klasse II Antigen-präsentierenden Molekülen ist die mCD1d Nut relativ schmal, tief und stark hydrophob und hat zwei Bindungstaschen statt der mehrere flache Taschen für die klassische beschriebenen MHC- kodierte Antigen-präsentierenden Molekülen. Basierend auf ihren Aminosäuresequenzen, bietet eine solche hydrobphobic Nut ein ideales Umfeld für die Bindung von Lipid-Antigene.
Die Natural Killer T (NKT-Zellen) nutzen ihre TCR an Glykolipide gebunden oder presented by CD1d erkennen. Reaktive T-Zellen, Lipide zu CD1 präsentiert haben in den Schutz gegen Autoimmun-und Infektionskrankheiten sowie in Tumorabstoßung beteiligt. So ist die Fähigkeit zu erkennen, zu reinigen, und verfolgen Sie die Reaktion der CD1-reaktiven NKT Zellen von großer Bedeutung. Die Erzeugung von Tetrameren von alpha Galactosylceramid (a-GalCer) mit CD1d hat einen tiefen Einblick in die Biologie von NKT-Zellen. Tetramere aus anderen CD1-Moleküle konstruiert wurden ebenfalls erzeugt und diese neue Reagenzien haben stark das Wissen um die Funktionen von Lipid-reaktiven T-Zellen erweitert, mit potenziellen Einsatz bei der Überwachung der Reaktion auf Lipid-basierte Impfstoffe und in der Diagnostik von Autoimmunerkrankungen und andere Behandlungen.
Protocol
Discussion
In diesem Verfahren wird gezeigt, wie zu initiieren, zu wachsen, zu infizieren Insektenzellen und wie die Baculovirus Verwendung dieser Zellen Titer. Die wichtigsten Aspekte dieses Verfahrens sind Wartung von Zellen und die genaue Titer von Baculovirus wissen. Sobald Sie CD1 Tetramere erzeugt wird, kann sie als ein mächtiges Werkzeug zur Analyse von Glycolipid reaktiven T-Zellen verwendet werden. Baculovirus-Systeme sind ebenfalls weit verbreitet, rekombinante Proteine, darunter MHC-Klasse-II-Tetramere so dieses Verfahren hat eine viel bre…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probe | S-866 |
Referências
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Naidenko, O. V., Maher, J. K., Ernst, W. A., Sakai, T., Modlin, R. L., Kronenberg, M. Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
