Одновременная изоляция высококачественных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов от сердца взрослых крыс
Summary
Было разработано и описано несколько протоколов для изоляции различных типов сердечных клеток от сердца крысы. Здесь описан оптимизированный протокол, который позволяет изолировать высококачественные основные типы сердечных клеток (кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты) от одного препарата, что снижает затраты на эксперименты.
Abstract
Крыса является важной моделью животного, используемой в исследованиях сердечно-сосудистой системы, и клетки сердца крыс используются для анализа in vitro молекулярных механизмов прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний, таких как сердечная гипертрофия, фиброз и атеросклероз. Хотя было предпринято несколько попыток с переменным успехом для разработки иммортализованных клеточных линий из сердечно-сосудистой системы, чтобы понять эти клеточные механизмы, первичные клетки предлагают более естественную и близкую к in vivo среду для таких исследований. Поэтому различные лаборатории, работающие на определенном типе клеток, разработали протоколы для изоляции отдельных типов клеток сердечной мышцы крысы, представляющих интерес. Однако протокол, который позволяет изолировать более одного типа ячеек, отсутствует. Здесь описан оптимизированный протокол, который позволяет изолировать высококачественные основные типы сердечных клеток (кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты) от одного препарата и дает возможностьR для клеточного анализа. Это позволяет наиболее эффективно использовать имеющиеся ресурсы, что может сэкономить время и снизить затраты на исследования.
Introduction
Модели грызунов давно используются в качестве инструментов для расширения нашего понимания сердечно-сосудистой физиологии в области здравоохранения и болезней. 1 Хотя эти модели на животных позволяют нам понять патофизиологию заболевания на уровне органа и проанализировать фармакокинетику и фармакодинамику различных фармакологических средств, используемых для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, понять молекулярные механизмы развития сердечно-сосудистых заболеваний и вклад конкретного Клеточного типа требует использования in vitro моделей клеточных культур. С этой целью были разработаны различные иммортализованные клеточные линии от сердечно-сосудистой системы; 2 , 3, однако, свежевыделенные первичные клетки физиологически и функционально более релевантны живым тканям и организмам.
Сердце – это универсальный орган, содержащий все основные типы клеток сердечно-сосудистой системыИ сердце крысы по-прежнему является широко используемой моделью для понимания сердечно-сосудистой физиологии. В течение последних нескольких десятилетий были описаны различные способы выделения отдельных типов клеток из сердечной ткани; 4 , 5 , 6 , 7, однако эти методы фокусируются только на выделении одного конкретного типа клеток, что приводит к потере других типов клеток, которые больше не могут использоваться для клеточного анализа. Здесь описывается оптимизированный протокол, который позволяет одновременно и качественно изолировать основные типы клеток сердечной ткани, то есть кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты. Все эти типы клеток могут быть использованы в различных экспериментальных установках 8 , 9 , 10 и для анализа взаимодействия между клетками одного и того же животного.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описан воспроизводимый протокол для изоляции и культивирования сердечных миоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов. Этот протокол описывает одновременное и высокое качество изоляции основных типов клеток сердечной ткани, то есть кардиомиоцитов, эндотелиальн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
С благодарностью признается техническая поддержка Л. Ринальди, С. Шеффера, Д. Рейтца, Х. Томаса и А. Вебера. Авторы также хотели бы поблагодарить доктора Э. Мартинсона за обширное чтение корректуры и редактирование текста рукописи. Исследование было поддержано грантом Университета Гиссена Аншубсфинансирунг для М. Аслама и Д. Гюндюза.
Materials
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
