Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz
Summary
Mehrere Protokolle wurden entwickelt und beschrieben für die Isolierung von verschiedenen Herzzelltypen von einem Rattenherz. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht, wodurch die experimentellen Kosten reduziert werden.
Abstract
Die Ratte ist ein wichtiges Tiermodell, das in der Herz-Kreislauf-Forschung verwendet wird, und Ratten-Herzzellen werden routinemäßig zur in-vitro- Analyse der molekularen Mechanismen der kardiovaskulären Erkrankung wie Herzhypertrophie, Fibrose und Atherosklerose verwendet. Obwohl mehrere Versuche mit variablem Erfolg gemacht wurden, um immortalisierte Zelllinien aus dem kardiovaskulären System zu entwickeln, um diese zellulären Mechanismen zu verstehen, bieten primäre Zellen eine natürliche und nahe an in vivo Umgebung für solche Studien. Daher haben verschiedene Laboratorien, die an einem bestimmten Zelltyp arbeiten, Protokolle entwickelt, um einzelne Arten von Ratten-Herzzellen von Interesse zu isolieren. Ein Protokoll, das die Isolierung von mehr als einem Zelltyp erlaubt, fehlt jedoch. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht und es ermöglichtEinsatz für zelluläre Analysen. Dies ermöglicht eine effizienteste Nutzung der verfügbaren Ressourcen, die Zeit sparen und die Forschungskosten senken können.
Introduction
Nagetiermodelle werden seit langem als Werkzeuge verwendet, um unser Verständnis der Herz-Kreislauf-Physiologie in Gesundheit und Krankheit zu erweitern. 1 Obwohl diese Tiermodelle es uns erlauben, die Pathophysiologie einer Erkrankung auf organischer Ebene zu verstehen und die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik verschiedener pharmakologischer Mittel zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, des Verständnisses der molekularen Mechanismen der Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Beitrags eines bestimmten zu analysieren Zelltyp erfordert die Verwendung von in vitro Zellkulturmodellen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene immortalisierte Zelllinien aus dem Herz-Kreislauf-System entwickelt; 2 , 3 aber frisch isolierte primäre Zellen sind physiologisch und funktionell relevanter für lebende Gewebe und Organismen.
Das Herz ist ein vielseitiges Organ, das alle gängigen Zelltypen des Herz-Kreislaufs enthältYstem, und das Rattenherz ist immer noch ein häufig verwendetes Modell für das Verständnis der Herz-Kreislauf-Physiologie. In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Methoden zur Isolierung einzelner Zelltypen aus Herzgewebe beschrieben; 4 , 5 , 6 , 7 Diese Methoden konzentrieren sich jedoch nur auf die Isolierung eines spezifischen Zelltyps, was zum Verlust von anderen Zelltypen führt, die für die zelluläre Analyse nicht mehr verwendet werden können. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die gleichzeitige und qualitativ hochwertige Isolierung der wichtigsten Zelltypen von Herzgewebe, dh Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten, ermöglicht. Alle diese Zelltypen können in verschiedenen Versuchsaufbauten 8 , 9 , 10 und zur Analyse von Zell-Zell-Wechselwirkungen aus demselben Tier verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel wird ein reproduzierbares Protokoll für die Isolierung und Kultur von Herz-Myozyten, Endothelzellen und Fibroblasten beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige und qualitativ hochwertige Isolierung der wichtigsten Zelltypen von Herzgewebe, dh Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten im Gegensatz zu nur einem Zelltyp. Ein kritischer Schritt in der Isolation ist die richtige Verdauung des Herzgewebes. Wenn die Verdauung unvollständig ist, kann noch eine große Anzahl von…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die technische Unterstützung von L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas und A. Weber ist dankbar anerkannt. Die Autoren danken auch Dr. E. Martinson für umfangreiche Korrekturlesen und Sprachbearbeitung des Manuskripts. Die Studie wurde von der Universität Giessen Anschubsfinanzierung für M. Aslam und D. Gündüz unterstützt.
Materials
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
Referências
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