בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר
Summary
כמה פרוטוקולים פותחו ותיארו לבידוד של סוגי תאים לב שונים של הלב חולדה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של איכות גבוהה תאים מרכזיים של תאים לב (cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת, הפחתת עלויות הניסוי.
Abstract
החולדה היא מודל חייתי חשוב המשמש במחקר לב וכלי דם, תאי חולדה חולדה משמשים באופן שגרתי לניתוח במבחנה של המנגנונים המולקולריים של התקדמות מחלות לב וכלי דם כגון היפרטרופיה לבבית, פיברוזיס וטרשת עורקים. למרות מספר ניסיונות עם הצלחה משתנה נעשו לפתח שורות תאים נצח מן המערכת הלב וכלי הדם כדי להבין את המנגנונים הסלולר, תאים ראשוניים מציעים סביבה טבעית קרוב יותר in vivo עבור מחקרים כאלה. לכן, מעבדות שונות העובדות על סוג תא מסוים פיתחו פרוטוקולים לבודד סוגים בודדים של תאי חולדה מעניינים של עניין. פרוטוקול המאפשר בידוד של יותר מסוג תא אחד, עם זאת, חסר. כאן פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של באיכות גבוהה סוגי תאים לב גדולים (cardiomyocytes, תאי האנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת ומאפשרתR לניתוחים סלולריים. זה מאפשר שימוש יעיל ביותר של המשאבים הזמינים, אשר עשוי לחסוך זמן ולצמצם עלויות מחקר.
Introduction
מודלים מכרסמים כבר זמן רב שימשו כלים כדי להרחיב את ההבנה שלנו של פיזיולוגיה לב וכלי דם בבריאות ומחלות. 1 למרות שמודלים אלו מאפשרים לנו להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלה ברמת האורגן ולנתח את הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של סוכני תרופה שונים המשמשים לטיפול במחלות לב וכלי דם, הבנה של המנגנונים המולקולריים של התפתחות מחלות לב וכלי דם ותרומתו של גורם מסוים סוג התא דורש שימוש במודלים תרבות תאים חוץ גופית . לשם כך פותחו קווי תאים שונים הנפתחים ממערכת הלב וכלי הדם; 2 , 3 עם זאת, תאים מבודדים טרי טרי הם פיזיולוגית ופונקציונלית רלוונטי יותר רקמות חיות אורגניזמים.
הלב הוא איבר צדדי המכיל את כל סוגי התאים העיקריים של הלב וכלי הדםYstem, ואת הלב חולדה הוא עדיין מודל נפוץ להבנת פיזיולוגיה של הלב וכלי הדם. במהלך העשורים האחרונים, שיטות שונות לבידוד של סוגי תאים בודדים מרקמת הלב תוארו; 4 , 5 , 6 , 7 עם זאת, שיטות אלה מתמקדים רק על בידוד של סוג תא מסוים אחד וכתוצאה מכך אובדן סוגים אחרים של תאים שאינם יכולים לשמש עוד לניתוח הסלולר. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד בו זמנית באיכות גבוהה של סוגי תאים עיקריים של רקמת הלב, כלומר cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts. כל סוגי תאים אלה ניתן להשתמש setups ניסיוני שונים 8 , 9 , 10 ו לניתוח של תא אינטראקציות התא מאותו בעל חיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, פרוטוקול לשחזור לבידוד ותרבויות של myocytes לב, תאי האנדותל, fibroblasts מתואר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד בו זמנית באיכות גבוהה של סוגי תאים עיקריים של רקמת לב, כלומר cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts לעומת סוג אחד בלבד התא. שלב קריטי בהליך הבידוד הוא העיכול הנכון של ר?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
התמיכה הטכנית של L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas ו- A. Weber מודה בהכרת תודה. המחברים מבקשים גם להודות לד"ר א. מרטינסון על הוכחות מקיפות לקריאה ועריכה בשפה של כתב היד. המחקר נתמך על ידי אוניברסיטת ג 'סן Anschubsfinanzierung מענק מ' אסלאם וד 'Gündüz.
Materials
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
Referências
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
