Samtidig isolasjon av kardiomyocytter av høy kvalitet, endotelceller og fibroblaster fra et voksen rottehjerte
Summary
Flere protokoller er blitt utviklet og beskrevet for isolering av forskjellige hjertecelletyper fra et rottehjerte. Her beskrives en optimalisert protokoll som muliggjør isolering av store hjertecelletyper av høy kvalitet (kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster) fra et enkelt preparat, noe som reduserer forsøkskostnadene.
Abstract
Rotta er en viktig dyremodell som brukes i kardiovaskulær forskning, og rottekardiale celler brukes rutinemessig for in vitro analyse av molekylære mekanismer for kardiovaskulær sykdomsprogresjon som hjertehypertrofi, fibrose og aterosklerose. Selv om flere forsøk med variabel suksess har blitt gjort for å utvikle immortaliserte cellelinjer fra kardiovaskulærsystemet for å forstå disse cellemekanismer, tilbyr primære celler et mer naturlig og nær in vivo miljø for slike studier. Derfor har forskjellige laboratorier som arbeider med en bestemt celletype utviklet protokoller for å isolere individuelle typer rotte-hjerteceller av interesse. En protokoll som tillater isolering av mer enn en celletype, mangler imidlertid. Her beskrives en optimalisert protokoll som muliggjør isolering av store hjertecelletyper av høy kvalitet (kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster) fra et enkelt preparat og gjør det mulig for deiR bruk for cellulære analyser. Dette tillater den mest effektive bruken av tilgjengelige ressurser, noe som kan spare tid og redusere forskningskostnadene.
Introduction
Gnagere har lenge vært brukt som verktøy for å utvide vår forståelse av kardiovaskulær fysiologi i helse og sykdom. 1 Selv om disse dyremodellene tillater oss å forstå patofysiologien til en sykdom på orgelnivå og å analysere farmakokinetikken og farmakodynamikken til ulike farmakologiske midler som brukes til behandling av kardiovaskulære sykdommer, forståelse av molekylære mekanismer for utvikling av kardiovaskulær sykdom og bidrag fra en bestemt Celletype krever bruk av in vitro -celledyrkningsmodeller. For dette formål er forskjellige immortaliserte cellelinjer fra kardiovaskulærsystemet blitt utviklet; 2 , 3 er ferske isolerte primære celler imidlertid fysiologisk og funksjonelt mer relevante for levende vev og organismer.
Hjertet er et allsidig organ som inneholder alle hovedtyper av celler i kardiovaskulære sYstem og rottehjerte er fortsatt en vanlig modell for forståelse av kardiovaskulær fysiologi. I de siste årtier har forskjellige metoder for isolering av individuelle celletyper fra hjertevev blitt beskrevet; 4 , 5 , 6 , 7, men disse metodene fokuserer kun på isolering av en bestemt celletype, noe som resulterer i tap av andre typer celler som ikke lenger kan brukes til cellulær analyse. Her beskrives en optimalisert protokoll som muliggjør samtidig og høy kvalitet isolering av de viktigste celletyper av hjertevev, dvs. kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster. Alle disse celletyper kan brukes i forskjellige eksperimentelle oppsett 8 , 9 , 10 og for analyse av celle-celle-interaksjoner fra samme dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen er en reproduserbar protokoll for isolering og kultur av hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster beskrevet. Denne protokollen beskriver samtidig og høy kvalitet isolering av de viktigste celletyper av hjertevev, dvs. kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster i motsetning til bare en celletype. Et kritisk trinn i isolasjonsprosedyren er riktig fordøyelse av hjertevevet. Hvis fordøyelsen er ufullstendig, kan det fortsatt oppnås et stort antall myocytter, men kvaliteten er svær…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den tekniske støtten til L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas og A. Weber er takknemlig anerkjent. Forfatterne ønsker også å takke Dr. E. Martinson for omfattende bevislesning og språkredigering av manuskriptet. Studien ble støttet av Universitetet i Giessen Anschubsfinanzierung til M. Aslam og D. Gündüz.
Materials
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
Referências
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
