Aislamiento simultáneo de cardiomiocitos de alta calidad, células endoteliales y fibroblastos de un corazón de rata adulto
Summary
Se han desarrollado y descrito varios protocolos para el aislamiento de diferentes tipos de células cardíacas de un corazón de rata. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación, reduciendo los costos experimentales.
Abstract
La rata es un importante modelo animal utilizado en la investigación cardiovascular, y las células cardíacas de rata se utilizan rutinariamente para el análisis in vitro de los mecanismos moleculares de la progresión de la enfermedad cardiovascular, tales como hipertrofia cardíaca, fibrosis y aterosclerosis. Aunque se han hecho varios intentos con éxito variable para desarrollar líneas celulares inmortalizadas desde el sistema cardiovascular para comprender estos mecanismos celulares, las células primarias ofrecen un entorno más natural y cercano al in vivo para tales estudios. Por lo tanto, diferentes laboratorios que trabajan en un tipo particular de células han desarrollado protocolos para aislar tipos individuales de células cardíacas de rata de interés. Sin embargo, falta un protocolo que permita el aislamiento de más de un tipo de célula. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación y permiteR para análisis celulares. Esto permite el uso más eficiente de los recursos disponibles, lo que puede ahorrar tiempo y reducir los costos de investigación.
Introduction
Los modelos de roedores se han utilizado durante mucho tiempo como herramientas para ampliar nuestra comprensión de la fisiología cardiovascular en la salud y la enfermedad. 1 Aunque estos modelos animales nos permiten comprender la fisiopatología de una enfermedad a nivel de órganos y analizar la farmacocinética y farmacodinámica de diversos agentes farmacológicos utilizados para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, la comprensión de los mecanismos moleculares del desarrollo de enfermedades cardiovasculares y la contribución de una enfermedad particular Tipo de célula requiere el uso de modelos de cultivo celular in vitro . Para este propósito se han desarrollado diferentes líneas celulares inmortalizadas del sistema cardiovascular; 2 , 3 sin embargo, las células primarias recién aisladas son fisiológica y funcionalmente más relevantes para los tejidos y organismos vivos.
El corazón es un órgano versátil que contiene todos los tipos principales de células del sistema cardiovascular.Y el corazón de la rata sigue siendo un modelo comúnmente utilizado para la comprensión de la fisiología cardiovascular. Durante las últimas décadas, se han descrito diferentes métodos para aislar tipos de células individuales del tejido cardíaco; 4 , 5 , 6 , 7 sin embargo, estos métodos se centran solamente en el aislamiento de un tipo celular específico que da como resultado la pérdida de otros tipos de células que ya no se pueden usar para el análisis celular. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento simultáneo y de alta calidad de los principales tipos celulares de tejido cardíaco, es decir, cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos. Todos estos tipos de células se pueden utilizar en diferentes configuraciones experimentales 8 , 9 , 10 y para el análisis de las interacciones célula-célula del mismo animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo se describe un protocolo reproducible para el aislamiento y el cultivo de miocitos cardíacos, células endoteliales y fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento simultáneo y de alta calidad de los principales tipos celulares de tejido cardíaco, es decir , cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos en oposición a un solo tipo celular. Un paso crítico en el procedimiento de aislamiento es la correcta digestión del tejido cardíaco. Si la digestión es incompleta, todav?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se agradece el apoyo técnico de L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas y A. Weber. Los autores también desean agradecer al Dr. E. Martinson por la lectura extensa de la prueba y la edición del lenguaje del manuscrito. El estudio fue apoyado por la Universidad de Giessen Anschubsfinanzierung concesión a M. Aslam y D. Gündüz.
Materials
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
Referências
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