Ekstraksjon og rensing av polyfenoler fra frysetørket bærpulver til behandling av vaskulære glatte muskelceller<em> I Vitro</em

Summary

Dette arbeidet beskriver en trinnvis metode for å fremstille polyphenolrike ekstrakter fra frysetørket bærpulver. I tillegg gir den en grundig beskrivelse av hvordan man bruker disse polyfenolrike ekstraktene i cellekultur i nærvær av peptidhormon angiotensin II (Ang II) ved bruk av vaskulære glatte muskelceller (VSMCs).

Abstract

Epidemiologiske studier indikerer at økt flavonoidinntak korrelerer med redusert dødelighet på grunn av hjerte-og karsykdommer (CVD) i USA og Europa. Bærene er mye konsumert i USA og har et høyt polyphenolisk innhold. Polyfenoler har vist seg å interagere med mange molekylære mål og utøve mange positive biologiske funksjoner, inkludert antioksidanter, antiinflammatoriske og kardioprotektive effekter. Polyfenoler isolert fra brombær (BL), bringebær (RB) og svart bringebær (BRB) reduserer oksidativt stress og cellulær senescens som svar på angiotensin II (Ang II). Dette arbeidet gir en detaljert beskrivelse av protokollen som brukes til å fremstille polyphenol-ekstraktene fra frysetørkede bær. Polyfenol ekstraksjoner fra frysetørket bærpulver ble utført ved anvendelse av 80% vandig etanol og en ultralydassistert ekstraksjonsmetode. Råekstraktet ble ytterligere renset og fraksjonert ved anvendelse av kloroform og etylacetat,henholdsvis. Effektene av både rå og rensede ekstrakter ble testet på Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs) i kultur.

Introduction

Polyfenoler er forbindelser som inneholder minst en fenolisk ring i deres struktur og er rikelig tilstede i planterike ¹ . Mennesker har spist planter i årtusener til medisinske formål uten å være klar over eksistensen av slike forbindelser ² . Mange frukter og grønnsaker har noen delte polyphenoliske forbindelser, om enn med forskjellige mengder, inkludert flavonoider, stilbener og fenol syrer ³ . Selv om polyfenoler ofte er forbundet med fargerike frukter og grønnsaker, er dette ikke helt sant. For eksempel er zeaxanthin og xantin til stede i grønnsaker som ikke er svært fargerike, som løk og hvitløk, som er fra familien av scallions og er forbundet med mange helsemessige fordeler ⁴ . Bortsett fra å være assosiert med flere helsemessige fordeler, tjener polyfenoler også planter ved å beskytte dem mot insekter ogD ultrafiolett stråling ² . Polyfenoler finnes ofte i det menneskelige kostholdet og betraktes som kraftige antioksidanter, da de kan scavenge Reactive Oxygen Species (ROS) ^{6 , 7 , 8} . De har også antiinflammatorisk ⁹ , antimikrobiell ¹⁰ , antihypertensiv ¹¹ og anti-kreftfremkallende ^{12 , 13} egenskaper.

Epidemiologiske studier viser en invers forbindelse mellom forbruket av flavonoider og kardiovaskulær sykdom (CVD) incidens ^{16 , 17} og dødelighet ^{14 , 15} . Bær er mye konsumert i USA og har høye mengder polyfenoler, inkludert flavonoider. For eksempel forbruk av blackberry (BL) juice (300 ML / d) i åtte uker signifikant redusert systolisk blodtrykk hos dyslipidemiske pasienter ¹⁸ . Jeong et al. ¹⁹ rapporterte at prehypertensive menn og kvinner som bruker 2,5 g svart bringebær (BRB) ekstrakt per dag, hadde lavere 24-timers og nattt blodtrykk sammenlignet med de som brukte en placebo. Hindbær (RB) reduserte blodtrykket mens du økte ekspresjonen av superoksiddismutase (SOD) i spontant hypertensive rotter ²⁰ . Det har nylig blitt vist at BL, RB og BRB reduserer nivåene av ROS og senescence indusert av angiotensin II (Ang II) i vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) ²¹ . I tillegg reduserte anthocyaninfraksjonen fra BL-ekstrakt ekspresjonen av inducerbar nitrogenoksydsyntase (iNOS) og hemmet aktiviteten av Nuclear Factor kappa B (NF-KB) og ekstracellulær signalregulert kinase (ERK) i lipopolysakkarid (LPS) -stimulert J774 cellerAss = "xref"> 22. BRB-ekstrakter reduserte NF-KB-aktiveringen og cyklooksygenase 2 (COX-2) -ekspresjonen in vitro ²³ , forbedret lipidprofilen og forhindret ateroskleroselesjonsdannelse hos mus med et fettfattig kosthold ²⁴ . Anthocyaniner, som betraktes som de mest omfattende flavonoider i bær, modulerer den inflammatoriske responsen i LPS-stimulerte RAW 264.7-makrofager ved å redusere Tumor Necrosis Factor alfa (TNF-a) -produksjonen ²⁵ og redusere proliferasjonen og migrasjonen av VSMCs ²⁶ .

Siden det har vært økende interesse for å forstå rollen av polyfenoler i menneskers helse og sykdom, er det viktig å optimalisere ekstraksjonsmetoden. Løsningsmiddelekstraksjon er mye brukt til det formålet, da det er kostnadseffektivt og enkelt reproduserbart. I denne studien ble en løsningsmiddelekstraksjon brukt med etanol, sammen med et ultralydassistert ekstraktN-metode, som ble tilpasset fra Kim og Lee ²⁷ . Rensingen og fraksjoneringen av råekstrakter (CE) ved anvendelse av kloroform og etylacetat ble utført for å oppnå den rensede ekstrakt (PE) fraksjon som ble tilpasset fra Queires et al., ²⁸ . Videre ble effekten av rå versus rensede polyfenolekstrakter fra BL sammenlignet med å redusere basal fosforylering av ERK1 / 2, og representative eksempler på den hemmeffekten av renset BL-polyfenol-ekstrakt på Ang II-induserte signalreduksjoner i VSMCs ble tilveiebrakt.

Protocol

1. Fremstilling av reagenser Tilbered 80% etanol (100 ml) ved å blande 80 ml absolutt etanol (molekylærbiologi-klasse) og 20 ml sterilt vann fra cellekulturer. For å forberede polyphenol ekstrakt (10 mg / ml) veier 10 mg CE eller PE. Tilsett 1 ml vanlig Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) under en cellekulturhette. Vortex løsningen. Aliquot i 200-l porsjoner og lagre ved -20 ° C. Forbered lysis buffer. Tilsett 5 ml 1 M HEPES stamløsning (pH 7,4; 50 mM slutt), 1 ml 5 M NaC…

Representative Results

Det har tidligere blitt påvist at polyfenolekstrakter isolert fra BL, RB og BRB reduserte senescensen av VSMCs som svar på Ang II 21 . Det har blitt vist at disse rensede polyfenolekstrakter modulerer Ang II-signalering ved å redusere fosforyleringen av Akt, p38-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) og ERK1 / 2. BL forhindrer senescens ved å redusere ekspresjonen av NADPH-oksidasen (Nox) 1, et enzym som produserer superoksydanioner og er sterkt oppregulert av …

Discussion

Polyfenoler isolert fra bær inneholder forskjellige sammensetninger. Den etanolbaserte ekstraksjonsprotokollen beskrevet her er tillatt for identifisering av forskjellige nivåer av fenoliske syrer og flavonoider som finnes i rå og rensede polyfenol ekstrakter av BL ( tabell 1 ). CE ble anriket i gallinsyre, ferulinsyre, 4-0-koffeokylsyre og 5-0-koffeokylsyre. Rensingsprosessen endret ikke signifikant nivåene av gallinsyre og p-kumarinsyre. Det økte imidlertid nivåene av 3- O- koeoylkinsyr…

Materials

Angiotensin II	Sigma-Aldrich, Inc.	A9525-10MG	Treatment of VSMCs
β-actin	Sigma-Aldrich, Inc.	A2228	Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit	Mercer Foods		Freeze-dried blackberry powder
Catalase	Calbiochem	219010	Primary antibody (1:1000)
Chloroform	Biotech Grd, Inc.	97064-678	Preparation of purified polyphenol extracts
DMEM	Mediatech, Inc.	10-014-CV	Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade)	Sigma-Aldrich, Inc.	E7023-500ML	Preparation of polyphenol extracts
Ethylacetate	Sigma-Aldrich, Inc.	439169	Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9102S	Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0	Teknova, Inc.	E0306	Lysis buffer
Freeze-Dryer	Labconco	VirTis Benchtop K	Preparation of polyphenol extracts
FBS	Seradigm	1400-500	Cell culture
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375	Lysis buffer
NaCl	EMD Millipore, Inc.	7760	Lysis buffer
NaF	J.T.Baker, Inc.	3688-01	Lysis buffer
Na3VO4	Sigma-Aldrich, Inc.	450243	Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate	Sigma-Aldrich, Inc.	S-9515	Lysis buffer
phospho ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9101S	Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich, Inc.	P8340-5ml	Lysis buffer
Protein assay dye reagent	Bio-Rad Laboratories, Inc.	500-0006	Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane	Thermo Scientific, Inc.	88518	Western blots
Rotatory Evaporator	Buchi Labortechnik	Rotavapor R3000	Preparation of polyphenol extracts
Sterile water	Mediatech, Inc.	25-055-CV	Preparation of polyphenol extracts
Sonicator	QSonica, LLC	Q125	Preparation of cell extracts
SOD2	Enzo Life Sciences, Inc.	ADI-SOD-110-F	Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich, Inc.	X100	Western blots
Whatman #2 filter paper	GE Healthcare, Inc.	28317-241	Preparation of polyphenol extracts