Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı
Summary
Bu çalışma, böbrek GFP transgenik zebra balığı kullanılarak segmental böbrek hasarının yeni bir in vivo modeli sunmaktadır. Model böbrek epitel hücrelerinin hedeflenen ablasyonunun indüksiyonuna izin vererek nefron hasarının ve onarımının hücresel mekanizmalarını gösterir.
Abstract
Akut Böbrek Hasarı (AKI), mortalite oranının yüksek olduğu ortak bir tıbbi durumdur. Böbreğin onarım yetenekleri ile, destekleyici tedaviden sonra yeterli böbrek fonksiyonunun sağlanması mümkündür. Bununla birlikte, nefron hücresi ölümünün ve onarımının hücre düzeyinde nasıl gerçekleştiğinin daha iyi anlaşılması, hücre ölümünü en aza indirgemek ve rejeneratif işlemi arttırmak için gereklidir. Zebrafish pronephros, memeli nefronuna benzer anatomik bölümler içerdiğinden, bu amaca ulaşmak için iyi bir model sistemdir. Daha önce, balıkta böbrek hasarını incelemek için kullanılan en yaygın model, farmakolojik gentamisin modeli idi. Bununla birlikte, bu model yaralanmanın spesifik zamansal olmayan kontrolüne izin vermemektedir ve böylelikle böbrek onarımı ile ilgili hücresel ve moleküler işlemleri incelemek zordur. Bu kısıtlılığın üstesinden gelmek için, bu çalışma, gentamisin yaklaşımının tersine, belirli bir Yeşil Fuoresent Protein (GFP) -ex'inNefron kesimi, mor bir lazer ışığı (405 nm) ile fotoablat edilebilir. AKI'nın bu yeni modeli, diğer epitelyal yaralanma yöntemlerinin eksik olduğu birçok avantaj sağlar. Başlıca avantajları, in vivo canlı hayvan modelinde, yaralanma seviyesini "aramak" ve spatio-temporal kontrolün doğru olmasıdır. Bu yeni yöntem, böbrek hasarının ve onarım mekanizmalarının anlaşılma düzeyini önemli ölçüde ilerletme potansiyeline sahiptir.
Introduction
Akut Böbrek Hasarı (AKI) 1 , 2 , aynı zamanda akut böbrek yetmezliği olarak da adlandırılabilir, böbrek fonksiyonunda ani bir bozukluk olarak tanımlanır 3 . Bu durumun anlaşılma düzeyi yıllar içinde kayda değer ölçüde gelişme gösterirken, morbidite ve mortalite oranları 1 , 2 gibi yüksek kalmıştır. İlaç tedavisinin çoklu klinik çalışmalarından elde edilen sonuçlar negatif 4 , 5 olduğu için, bu durum için mevcut tedavi çoğunlukla destekleyici niteliktedir. Böbrek kendine tamir etme kabiliyeti açısından eşsizdir. Bu nedenle, AKI'nın erken tanısından sonra destekleyici tedavi morbiditeyi sınırlamanın en iyi yoludur 6 . Bununla birlikte, AKI'nın erken tespit edilmesi zordur ve mortalite oranı diyaliz gerektirenler için% 50-80 arasında inanılmaz derecede yüksektir 5. Böbreklerin kendini onarma becerisi ve bu durum için tedavi seçenekleri bulunmaması nedeniyle, bu nefron rejenerasyon sürecini zenginleştirmek için yöntemler geliştirmek önemlidir.
Farklı yaralanma ve hayvan modelleri içeren AKI araştırması için kullanılan birçok farklı model olmuştur. Böbrek hasarı ajanları açısından, aminoglikozid antibiyotik gentamisin nefrotoksik bir madde olarak kullanılır ve bu da AKI 7,8'e yol açar. Bununla birlikte, birkaç grup gentamisin tedavisinin zebra balığı embriyo 9 için ölümcül olduğunu buldu. Embriyo iyileşmesi için çok ciddi boru hasarına neden olur, böylece bir yenilenme türü olmaksızın yenileme çalışmasını zorlaştırır. Fare ve fare gibi memeli modelleri de değerli sayılır, ancak AKI çalışması sırasında birçok sınırlama ile karşı karşıya kalırlar. Belki de kemirgen modellerin en büyük dezavantajı visua'daki zorlukturKemirgen böbreğini hafifletir ve böylece epitel ölümüne ve onarımına yol açan spatio-temporal süreçleri belirler.
Johnson ve ark. Embriyonik ve larval zebrafish 9 akut böbrek hasarını indüklemek için bir lazer ablasman tabanlı teknik bildirdiniz. Dekstran konjügatları ile intramusküler bir enjeksiyon sonrasında böbrek hasarına pulsed lazer ablasyon uyguluyorlardı. Dekstran konjügatlarından gelen flüoresans, tübül epitelinde hasarın ve rejenerasyonun görselleştirilmesine izin verir 9 . Bu model, yukarıda bahsedilen iki sınırlamanın üstesinden gelmekle birlikte, dereceli yaralanmalara izin vermez ve büyük, keyfi hücre gruplarında gerçekleştirmek zordur.
Burada açıklanan yeni lazer ablasyon tabanlı zebrafish modeli, yukarıdaki tüm sınırlamaları ele almaktadır. Larval zebra biflinde pronefrik böbrek, memeli hayvanlara benzer kesimler içeren olgun, işleyen bir organtır.Bir glomerulus, proksimal ve distal tübüller ve bir toplama kanalı 10 dahil olmak üzere phron. Zebra balığı larva da optik olarak şeffaftır, böylelikle flüoresan teknikleri ile böbrek gözlemlenebilir. Dolayısıyla, zebra balığı, AKI'nın in vivo bir değerli modelidir ve böbrek hasarına ve onarımına katılan hücresel ve moleküler işlemleri incelemek için larval pronefrik böbrek (5-12 gün-dölleme sonrası (dpf)) kullanılabilir.
Bu makale, belirli Green Floresan Protein (GFP) ifade eden nefron bölümlerinin, düşük enerjili (darbeli bir lazer sistemi ile karşılaştırıldığında) mor renkli lazer ışığını (405 nm) kullanarak fotoablat edebildiği bir yöntem sunmaktadır. GFP floresansı, bir grup hücrenin hedeflenmesini sağlar; bu da, GFP photobleaching gözlemiyle görünür olan değişiklikleri yapar. Ek olarak, GFP (mor ışığı absorbe ederek), GFP ifade eden böbrek hücrelerindeki yaralanmayı güçlendiren bir enerji havuzu olarak görev yapmaktadır. Zaman atlamalı mikrolerOnarım işlemini incelemek için kopya kullanılabilir. Çalışmalar, hücre çoğalması, hücre göçü ve hücre metaplazisinin 11 , 12 , 13'ün hepsinin böbrek tamirinde önemli bir rol oynayabilecek potansiyel süreç olduğunu bulmuştur. Bununla birlikte, mevcut AKI modellerinin sınırlamaları nedeniyle, bu süreçlerin nispi önemi ve etkileşimlerinin ayrıntılarının ortaya çıkması zor olmuştur. Bu yeni yaklaşımı kullanarak akut hasardan sonra böbrek tamirinde hücre göçünün merkezi bir rol oynadığını göstermek mümkün oldu 14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Toplam lazer gücünün, sistemlere göre değiştiği unutulmamalıdır. Bununla birlikte, yüzde GFP fotobloklama kullanıldığında, floresan böbrekine gönderilen toplam enerjinin, lazer gücündeki değişimden bağımsız olarak okunması ve maruz kalma süresi boyunca telafi edilmesine izin verilmektedir. Bununla birlikte, farklı dokuların bu fotoablasyon yöntemine tepkisinin değiştiğini unutmayın. Böbrek olgunlaşması sırasında bile, genç embriyolarda olgun larvalara göre GFP floresansında% 50…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Iain Drummond ve Dr. Vladimir Korzh'a böbrek GFP transgenik hatlarını paylaştıkları için teşekkür ediyoruz. Ayrıca, bu çalışmayı yürütmek için gerekli kaynaklar sağladığı için NYITCOM'a teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen hibe desteği ile sağlanmıştır: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) ve HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Petri Dishes, 35 x 10mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4,2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
Referências
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
