Um multi-furo criotubo Elimina congelação Artifacts quando tecidos musculares são directamente Imerso em azoto líquido
Summary
Este protocolo descreve um processo para congelar os tecidos musculares, mergulhando-os directamente em azoto líquido. Este protocolo também realça um novo frasco de congelação que pode evitar o "efeito manta" de gás de azoto quando os contactos de azoto líquido da superfície do tecido de um espécime.
Abstract
Estudos sobre a fisiologia do músculo esquelético enfrentar o desafio técnico de processar adequadamente as amostras para obtenção de cortes com compartimentos citoplasmáticos claramente visíveis. Outro obstáculo é a aposição apertada de miofibras para os tecidos circundantes. Uma vez que o processo de fixação do tecido e parafina leva ao encolhimento das fibras musculares, congelamento é um meio óptimas de endurecimento tecido muscular para seccionamento. No entanto, um problema vulgarmente encontrado, a formação de cristais de gelo, ocorre durante a preparação de secções congeladas por causa do elevado teor de água de músculo. O protocolo aqui apresentado descreve um primeiro método simples e eficiente para a congelação de tecidos musculares adequadamente por imersão em azoto líquido. O problema com o uso de azoto líquido sozinho é que ele provoca a formação de uma barreira de gás de azoto ao lado do tecido, que actua como um isolador e inibe o arrefecimento dos tecidos. Para evitar este efeito "cobertor de vapor", a new criotubo foi concebido para aumentar a velocidade do fluxo de líquido em torno da superfície do tecido. Isto foi conseguido por perfuração de um total de 14 orifícios de entrada na parede do frasco. De acordo com a dinâmica de bolha, uma taxa mais elevada de resultados de escoamento de líquido em bolhas mais pequenas e menos possibilidades de formar uma barreira ao gás. Quando azoto líquido flui para dentro do frasco de congelação através dos orifícios de entrada de ar, a velocidade do fluxo em torno do tecido é suficientemente rápido para eliminar a barreira de gás. Em comparação com o método de congelação dos tecidos musculares usando isopentano pré-arrefecido, este protocolo é mais simples e mais eficiente e pode ser usada para congelar músculo de um modo de transferência. Além disso, este método é ideal para instituições que não têm acesso a isopentano, que é extremamente inflamável à temperatura ambiente.
Introduction
O músculo esquelético é o componente mais valioso de um animal produtor de carne a partir do ponto de vista nutricional e processamento. Na indústria da carne, há dois aspectos especialmente críticos: a eficiência de crescimento muscular e a qualidade da carne resultante. Como um componente principal do músculo, as fibras musculares estão directamente relacionadas com o desempenho do crescimento e qualidade da carne fresca em animais 1. Por exemplo, o número total de fibras (TNF) e a área da secção transversal das fibras (CSAF) principalmente determinar a massa muscular e a qualidade da carne; Também, Tipo de fibra Composição (FTC) afeta fortemente a qualidade da carne fresca 2. Portanto, a manipulação de características da fibra muscular em animais é um método altamente eficaz para aumentar a rentabilidade do núcleo e da competitividade de quintas 1.
Até à data, vários factores intrínsecos e extrínsecos têm sido identificados para manipular characterist fibra muscularics 1. Esta manipulação pode ser obtida através da escolha adequada dos animais com genes específicos, tais como o gene da miostatina em gado 3, o gene Callipyge em ovelhas 4, e o RYR1 e genes IGF2 em porcos 5. Além disso, o controle da dieta e tratamentos com hormônios específicos desempenham um papel importante em características da fibra muscular 6. Assim, uma abordagem que combina fatores genéticos e nutricionais pode ser capaz de melhorar o teor de carne magra e qualidade da carne. No entanto, os estudos sobre fibras musculares estão limitados na indústria da carne, porque a elucidação da estrutura de fibras musculares é ainda um desafio.
propriedades da fibra muscular são identificados utilizando métodos histoquímicos, tais como o ensaio de miosina adenosina trifosfatase (ATPase). Este método baseia-se no facto de enzimas localizadas em secções finas (6-8? M) congelados defibras musculares pode ser feito reagir quimicamente com determinados produtos. No entanto, o teor de água de músculos é maior do que 75% em porcos, coelhos, ratos e seres humanos, independentemente da posição (isto é, costas, abdómen, ou dos membros posteriores) 7. Tal teor de humidade elevado em músculos provoca um problema vulgarmente encontrado – congelação artefactos – durante a preparação dos criocortes, como anteriormente descrito 8, 9. Na maioria dos casos, é quase impossível para congelar adequadamente tecidos musculares em uma linha de produção matadouro, de acordo com a nossa experiência.
O protocolo aqui apresentado descreve um método simples e eficiente utilizado no nosso laboratório para congelar tecidos musculares para cryosectioning de um modo de elevado rendimento. O destaque do presente método é um novo frasco de congelação que é concebido para tecidos musculares de flash-congelação em azoto líquido. O fluxo de trabalho de corrente pode simultaneamente facilitar tecidoscongelamento e processamento para uma excelente criocorte muscular, com um compartimento citoplasmático claramente visível e a aposição apertada de miofibras para o tecido circundante. Além disso, este protocolo pode ser aplicado a uma grande variedade de opções para a análise de tecido por causa de azoto líquido não se mistura com os tecidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um novo, cryovial multi-buraco para congelar e armazenar os tecidos musculares para realizar avaliações histológicas da função muscular. O passo crítico modificado neste protocolo é que a amostra no criotubo multi-furo é directamente imerso em azoto líquido. Para o nosso conhecimento, esta é a maneira mais simples e rapidest obter excelentes amostras congeladas para cryosectioning muscular entre os métodos de congelação existentes (ver os resultados representativos).
<p class="jove_con…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (NSFC): 31301950 e 31671288.
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
Referências
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