A Multi-agujero criovial Elimina congelación Artifacts cuando los tejidos musculares se sumergen directamente en nitrógeno líquido
Summary
Este protocolo describe un procedimiento para congelar los tejidos musculares al sumergirse directamente en nitrógeno líquido. Este protocolo también pone de relieve un nuevo criovial que puede evitar el "efecto manta" de gas nitrógeno cuando los contactos de nitrógeno líquido la superficie del tejido de un espécimen.
Abstract
Los estudios sobre la fisiología del músculo esquelético se enfrentan al desafío técnico de procesar adecuadamente las muestras para obtener secciones con compartimentos citoplasmáticos claramente visibles. Otro obstáculo es la aposición estrecha de las miofibrillas a los tejidos circundantes. Debido a que el proceso de fijación del tejido y la inclusión en parafina conduce a la contracción de las fibras musculares, de congelación es un medio óptimos de endurecimiento tejido muscular para seccionar. Sin embargo, un problema comúnmente encontrado, la formación de cristales de hielo, se produce durante la preparación de secciones congeladas debido a la alto contenido de agua de los músculos. El protocolo que se presenta aquí describe primero un método simple y eficiente para congelar adecuadamente tejidos musculares sumergiéndolos en nitrógeno líquido. El problema con el uso de nitrógeno líquido solo es que causa la formación de una barrera de gas nitrógeno al lado del tejido, que actúa como un aislante e inhibe la refrigeración de los tejidos. Para evitar este efecto "manta de vapor", un necriovial w fue diseñado para aumentar la velocidad de flujo de líquido alrededor de la superficie del tejido. Esto se logró mediante la perforación de un total de 14 agujeros de entrada en la pared del vial. De acuerdo con la dinámica de burbujas, una mayor tasa de resultados de flujo de líquido en burbujas más pequeñas y menos posibilidades de formar una barrera a los gases. Cuando el nitrógeno líquido fluye en el criovial a través de los agujeros de entrada, la velocidad del flujo alrededor del tejido es lo suficientemente rápido para eliminar la barrera de gas. En comparación con el método de congelar los tejidos musculares usando isopentano previamente enfriado, este protocolo es más simple y más eficiente y se puede usar para congelar músculo de una manera rendimiento. Además, este método es óptimo para las instituciones que no tienen acceso a isopentano, que es extremadamente inflamable a temperatura ambiente.
Introduction
El músculo esquelético es el componente más valioso de un animal de producción de carne desde el punto de vista nutricional y procesamiento. En la industria de la carne, hay dos aspectos especialmente críticos: la eficiencia del crecimiento del músculo y la calidad de la carne resultante. Como componente principal del músculo, las fibras musculares están directamente relacionados con el crecimiento y la calidad de la carne fresca en animales 1. Por ejemplo, el número total de fibras (TNF) y el Área de sección transversal de fibras (CSAF) principalmente determinan la masa muscular y calidad de la carne; También, Tipo de fibra Composición (FTC) afecta en gran medida la calidad de la carne fresca 2. Por lo tanto, la manipulación de características de la fibra muscular en los animales es un método altamente eficaz para aumentar la rentabilidad del núcleo y competitividad de las explotaciones 1.
Hasta la fecha, varios factores intrínsecos y extrínsecos se han identificado para manipular, ambie fibra muscularics 1. Esta manipulación se puede lograr a través de la selección específica de los animales con genes específicos, tales como el gen de la miostatina en el ganado 3, el gen Callipyge en ovejas 4, y el RYR1 y genes IGF2 en cerdos 5. Además, el control de la dieta y los tratamientos con hormonas específicas juegan un papel importante en características de la fibra muscular 6. Por lo tanto, un enfoque que combina los factores genéticos y nutricionales podría ser capaz de mejorar el contenido de carne magra y calidad de la carne. Sin embargo, los estudios sobre las fibras musculares están limitados en la industria de la carne debido a la elucidación de la estructura de las fibras musculares todavía es un reto.
propiedades de la fibra muscular se identifican utilizando métodos histoquímicos, tales como el ensayo de la miosina adenosina trifosfatasa (ATPasa). Este método se basa en el hecho de que las enzimas encuentra en secciones delgadas (6-8 m) congelados defibras musculares se pueden hacer reaccionar químicamente con ciertos productos. Sin embargo, el contenido de agua de los músculos es mayor que 75% en cerdos, conejos, ratones y seres humanos, independientemente de la posición (es decir, la espalda, abdomen, o de las extremidades posteriores) 7. Tal alto contenido de humedad en los músculos causa un problema comúnmente encontrado – congelación artefactos – durante la preparación de criosecciones, como se describió previamente 8, 9. En la mayoría de los casos, es casi imposible para congelar adecuadamente los tejidos musculares en una línea de producción del matadero, de acuerdo con nuestra experiencia.
El protocolo que se presenta aquí describe un método simple y eficiente utilizado en nuestro laboratorio para congelar los tejidos musculares para cryosectioning en una forma de alto rendimiento. El punto culminante de este método es un nuevo criovial que está diseñado para tejidos musculares de flash-congelación en nitrógeno líquido. El flujo de trabajo actual puede facilitar simultáneamente tejidocongelación y de procesamiento para una excelente cryosection muscular, con un compartimiento citoplasmático claramente visible y la estrecha aposición de miofibras en el tejido circundante. Además, este protocolo se puede aplicar a una amplia gama de opciones para el análisis del tejido porque el nitrógeno líquido no se mezcla con los tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A continuación, describimos una nueva, criovial múltiples orificios para la congelación y el almacenamiento de los tejidos musculares para llevar a cabo las evaluaciones histológicas de la función muscular. El paso modificado crítico en este protocolo es que la muestra en el criovial multi-agujero se sumerge directamente en nitrógeno líquido. A nuestro entender, esta es la manera más simple y rapidest obtener excelentes muestras congeladas para cryosectioning muscular entre los métodos de congelación existent…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF): 31301950 y 31671288.
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
Referências
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