LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات
Summary
هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من طول فترة طويلة للكهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الأسلوب. هذا هو منهجية جديدة تمكن لتقدير مرة الأولى، وتوصيف الجلوتامين والأسباراجين الإسوية نزع الأميد من البروتينات طلقات نارية.
Abstract
توصيف نزع الأميد البروتين لا بد من فك دور (ق) وإمكانات هذا البروتين posttranslational تعديل (PTM) في علم الأمراض البشرية وغيرها من السياقات البيوكيميائية. من أجل أداء توصيف نزع الأميد البروتين، وقد وضعنا مؤخرا رواية طويل طول كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الطريقة التي يمكن فصل الجلوتامين (GLN) والهليونين (الأسباراجين) شكل الإسوي منتجات نزع الأميد من المركبات نموذج لعينات بيولوجية معقدة للغاية. LERLIC-MS / MS هو، وبالتالي فإن أول استراتيجية البروتينات بندقية لفصل وتقدير من الأشكال الإسوية نزع الأميد GLN. علينا أن نبرهن أيضا، والجدة، أن البروتوكول تجهيز العينات المذكورة هنا تستقر succinimide سيطة السماح توصيف من خلال LERLIC-MS / MS. تطبيق LERLIC-MS / MS كما هو موضح في هذه المقالة الفيديو يمكن أن تساعد على توضيح أونكنوو حالياالمصفوفات ن الجزيئية لنزع الأميد البروتين. بالإضافة إلى ذلك، يوفر LERLIC-MS / MS مزيد من فهم التفاعلات الأنزيمية التي تشمل نزع الأميد في الخلفيات البيولوجية متميزة.
Introduction
نزع الأميد هو تعديل البروتين posttranslational (PTM) الذي يقدم شحنة سالبة إلى العمود الفقري البروتين من خلال تعديل الهليونين (الأسباراجين) و / أو الجلوتامين (GLN) بقايا 1. هذا التعديل في حين تؤثر بقايا الأسباراجين يولد المنتجات ايزوميريا حمض isoaspartic (isoAsp) و n حمض -aspartic (الحية) في المشترك 3: نسبة 2 1. وعلى الرغم من أن هذه النسبة يمكن أن تتغير من خلال تدخل انزيم اصلاح-L isoaspartyl ناقلة الميثيل (PIMT) 3، 4. وبالمثل، نزع الأميد من بقايا GLN يولد الأحماض ايزوميريا جاما الجلوتاميك (γ-غلو) والأشكال الإسوية حمض الفا لالجلوتاميك (α-غلو) في متوقعة 1: 7 نسبة 3، 5، ولكن هذه النسبة يمكن أن تحول بفعل في كل مكان إنزيم الغلوتامين (2) وtransglutaminases الأخرى، بما في ذلك ناقلة الغلوتامين 1، عن طريق البريدnzyme التي تم تحديدها مؤخرا كما يرتبط مع حويصلات خارج الخلية في الدماغ 6.
أصل نزع الأميد يمكن أن تكون عفوية أو الأنزيمية، والسابق هو شائع بشكل خاص على بقايا GLN التي transglutaminases والأنزيمات الأخرى توسط أمور يشابك / داخل الجزيئي عبر transamidation (انظر 3 للحصول على مزيد من التفاصيل حول GLN transamidation وآثارها في عدة المزمنة و الأمراض التي تصيب الإنسان قاتلة). ولذلك، نزع الأميد هو PTM له تداعيات حاسمة على بنية ووظيفة الجزيئات تتأثر 4 و 7 و 8 و يتطلب الخواص الكيميائية في عمق 3 في ضوء نتائج البيوكيميائية المتنوعة بما في ذلك خدماتها على مدار الساعة كما الجزيئية الشيخوخة 9 .
وبالرغم من أن نزع الأميد من بقايا الأسباراجين نسبيا جيدا تتميز من قبل من أسفل إلى أعلى بندقية البروتينات 1، 10، نزع الأميد من بقايا GLN لا يزال لايوجد طريقة توصيف مناسبة ما وراء التحليل تحديا من المركبات النموذج من قبل القائم على الإلكترون تجزئة جذري 11. لقد وضعت مؤخرا رواية بعد واحد البروتينات بندقية استراتيجية (LERLIC-MS / MS) 3 التي تمكن فصل GLN والأسباراجين الإسوية نزع الأميد من العينات البيولوجية المعقدة والمركبات نموذج في تحليل واحد. ويستند LERLIC-MS / MS على الفصل بين الببتيدات تريبسيني هضمها باستخدام طول طويلة (50 سم) عمود التبادل الأيوني (LAX) العمل على وضع كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني (ERLIC) وإلى جانب لجنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC- MS / MS). وقد استخدمت هذه الاستراتيجية تحليلية جديدة لتوصيف وquantitate نسبيا مدى كل بقايا deamidated في أنسجة الدماغ البشريو "> 3. ومع ذلك، فإن بروتوكول المذكورة هنا توفر التصوير الفيديو من LERLIC-MS / MS تهدف لدراسة خصائص نزع الأميد البروتين في سياق الكيمياء الحيوية من الفائدة.
بيان الأخلاق
وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من هذا البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة نانيانغ التكنولوجية في سنغافورة وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا الفيديو المقال نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من LERLIC-MS / MS 3، وهي طريقة لأداء توصيف معمقة وتحديد دقيق لمدى نزع الأميد البروتين والعمليات الأنزيمية المعنية على هذا التعديل البروتين. ويستند LERLIC-MS / MS على استخدام طول طويلة (50 سم) LAX وفقا لمبدأ كهرباء-التنافر م…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل في جزء بدعم من المنح المقدمة من سنغافورة وزارة التربية والتعليم (المستوى 2: منح ARC9 / 15)، مجلس البحوث الطبية الوطنية في سنغافورة (NMRC-OF-IRG-0003-2016)، وجامعة تايوان الوطنية، NHG بحوث الشيخوخة غرانت ( منحة ARG / 14017). ونود أن نعرب عن امتناننا وشكرنا خالص للدكتور أندرو ألبرت وفريق PolyLC لتوفير تتكرم لنا مع مواد التعبئة والتغليف التي جعلت ذلك ممكنا هذه الدراسة.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
Referências
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O’Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)–a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
