LERLIC-MS / MS for Indgående Karakterisering og Kvantificering af glutamin og asparagin deamidering i Shotgun Proteomics
Summary
Her præsenterer vi en trin-for-trin-protokollen af den lange længde elektrostatisk frastødning-hydrofil interaktionskromatografi-tandem massespektrometri (LERLIC-MS / MS) metode. Dette er en hidtil ukendt metode, som gør det muligt for første gang kvantificering og karakterisering af glutamin og asparagin deamideringssteder isoformer med shotgun proteomics.
Abstract
Karakterisering af protein deamidering er bydende nødvendigt at dechifrere den rolle (r) og muligheder af dette protein posttranslationel modifikation (PTM) i human patologi og andre biokemiske sammenhænge. For at udføre karakterisering af protein deamidering, har vi for nylig udviklet en ny lang længde elektrostatisk frastødning-hydrofil interaktionskromatografi-tandem massespektrometri (LERLIC-MS / MS) metode, der kan adskille glutamin (Gln) og asparagin (Asn) isoform produkter af deamidering fra modelforbindelser til meget komplekse biologiske prøver. LERLIC-MS / MS er derfor den første shotgun proteomics strategi til separation og kvantificering af Gin deamideringssteder isoformer. Vi demonstrerer også, som en nyhed, at prøven behandlingsprotokol her skitserede stabiliserer succinimid mellemprodukt tillader dets karakterisering ved LERLIC-MS / MS. Anvendelse af LERLIC-MS / MS, som vist i denne video artikel kan hjælpe til at belyse den aktuelt unknown molekylære opstillinger af protein deamidering. Derudover LERLIC-MS / MS tilvejebringer yderligere forståelse af de enzymatiske reaktioner, der omfatter deamidering i distinkte biologiske baggrunde.
Introduction
Deamidering er et protein posttranslationel modifikation (PTM), som indfører en negativ ladning til proteinet backbone ved modifikation af asparagin (Asn) og / eller glutamin (Gin) resterne 1. Denne modifikation mens påvirke Asn-rester genererer isomere produkter isoaspartic syre (isoAsp) og n asparaginsyre (Asp) ved en fælles 3: 1 forhold 2. Uanset, kan dette forhold ændres ved indgriben fra reparation enzym L-isoaspartyl methyltransferase (PIMT) 3, 4. Tilsvarende deamidering af Gin rester genererer den isomere gamma-glutaminsyre (γ-Glu) og alfa-glutaminsyre isoformer (α-Glu) på et forventet 1: 7 forhold 3, 5, men dette forhold kan forskydes ved indvirkning af den allestedsnærværende enzym transglutaminase 2 og andre transglutaminaser, herunder transglutaminase 1, en enzyme nylig identificeret som er forbundet med ekstracellulære vesikler i hjernen 6.
Oprindelsen af deamidering kan enten spontan eller enzymatisk, førstnævnte er især almindeligt på Gin-rester, hvori transglutaminaser og andre enzymer medierer inter / intra-molekylær tværbinding via transamidering (se 3 for yderligere detaljer om Gin transamidering og dens konsekvenser i flere kronisk og dødelige sygdomme hos mennesker). Derfor, deamidering er en PTM, der har en afgørende indflydelse på den struktur og funktion af berørte molekyler 4, 7, 8 og kræver en tilbundsgående kemiske karakterisering 3 i lyset af dets forskellige biokemiske konsekvenser herunder dets tjeneste som molekylære ur af ældning 9 .
Skønt deamidering af Asn-rester er blevet relativt velkarakteriseret ved bottom-up shotgun proteomics 1, 10, deamidering af Gin rester stadig ikke har en egnet karakterisering fremgangsmåde ud over den udfordrende analyse af modelforbindelser ved elektron-radikal fragmentering 11. Vi har for nylig udviklet en ny én dimension shotgun proteomics strategi (LERLIC-MS / MS) 3, der muliggør adskillelse af Gin og Asn deamideringssteder isoformer fra komplekse biologiske prøver og modelforbindelser i en enkelt analyse. LERLIC-MS / MS er baseret på adskillelsen af tryptiske spaltet peptider under anvendelse af en lang længde (50 cm) ionbyttersøjle (LAX) arbejder på elektrostatisk frastødning-hydrofil interaktionskromatografi (ERLIC) -tilstand og koblet til tandem-massespektrometri (LC- MS / MS). Denne nye analytiske strategi er blevet anvendt til at karakterisere og relativt kvantificere udstrækningen af de deamideret rest i humane hjernevævf "> 3. Ikke desto mindre vil protokollen beskrevet her giver video billeddannelse af LERLIC-MS / MS til formål at studere de særlige forhold protein deamidering i den biokemiske sammenhæng af interesse.
ETIK OVERSIGT
Alle procedurer vedrørende denne protokol er blevet godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelsen for Nanyang Technological University i Singapore og er udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne video-artikel præsenterer vi en trin-for-trin-protokollen af LERLIC-MS / MS 3, en fremgangsmåde udføre grundig karakterisering og til nøjagtigt at bestemme omfanget af protein deamidering og enzymatiske processer, der er involveret på dette protein modifikation. LERLIC-MS / MS er baseret på anvendelsen af en lang længde (50 cm) LAX henhold til princippet om elektrostatisk frastødning-hydrofil interaktionskromatografi (ERLIC) 27. Anvendelsen af en lang læng…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Singapore Undervisningsministeriet (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Council of Singapore (NMRC-AF-IRG-0003-2016), og NTU-NHG Aldringsforskning Grant Medical Research ( Grant ARG / 14017). Vi vil gerne udtrykke vores taknemmelighed og mest oprigtige tak til Dr. Andrew Alpert og PolyLC team for venligt forsynet os med den emballage, den muliggjorde denne undersøgelse.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
Referências
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O’Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)–a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
