Hier geven we een stap-voor-stap protocol van de lange lengte elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) methode. Dit is een nieuwe methode die het mogelijk maakt voor het eerst kwantificering en karakterisering van glutamine en asparagine deamidering isovormen door shotgun proteomics.
Karakterisatie van eiwitdeamiderende is noodzakelijk om de rol (len) en de mogelijkheden van deze eiwitten posttranslationele modificatie (PTM) in humane pathologie en andere biochemische context ontcijferen. Ter karakterisering van eiwitten deamidatie voeren, hebben wij onlangs een nieuwe lange-length elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) werkwijze die het glutamine (Gln) en asparagine (Asn) isovorm kan scheiden producten van de deamidatie van modelverbindingen zeer complexe biologische monsters. LERLIC-MS / MS is dus de eerste shotgun proteomics strategie voor de scheiding en kwantificering van Gin deamidatie isovormen. We tonen ook als noviteit, dat het monster verwerkingsprotocol geschetste stabiliseert het succinimide tussenliggende waardoor de karakterisering van LERLIC-MS / MS. Toepassing van LERLIC-MS / MS zoals weergegeven in deze video artikel kan u helpen om op te helderen de op dat moment onbekenden moleculaire arrays van eiwit deamidatie. Bovendien LERLIC-MS / MS verschaft verder inzicht in de enzymatische reacties die deamidatie bij onderscheiden biologische achtergronden omvatten.
Deamidering is een proteïne posttranslationele modificatie (PTM) dat een negatieve lading aan het eiwit skelet geïntroduceerd door middel van modificatie van asparagine (Asn) en / of glutamine (Gln) resten 1. Deze modificatie terwijl beïnvloeden Asn residuen genereert de isomere producten isoaspartaamzuur (isoAsp) en n -aspartic acid (Asp) bij een gemeenschappelijke 3: 1 verhouding 2. Ondanks deze verhouding kan worden gewijzigd door tussenkomst van de reparerende enzym L-isoaspartyl methyltransferase (PIMT) 3, 4. Evenzo deamidering van Gln residuen genereert isomere gamma-glutaminezuur (γ-Glu) en alfa-glutaminezuur isovormen (α-Glu) en een verwachte 1: 7 verhouding van 3, 5, doch deze verhouding kan worden geschoven door de werking van de alomtegenwoordige enzym transglutaminase 2 en andere transglutaminasen, zoals transglutaminase 1, enzyme onlangs geïdentificeerd als geassocieerd met extracellulaire blaasjes in de hersenen 6.
De oorsprong van deamidatie kan hetzij spontaan of enzymatisch worden, de eerste is vooral gebruikelijk op Gin residuen waarin transglutaminasen en andere enzymen mediëren inter / intramoleculaire verknoping via transamideringsprodukt (zie 3 voor meer details over Gin transamideringsprodukt en de implicaties verschillende chronische en dodelijke ziekten bij de mens). Daarom, deamidering is een doorvoermechanisme die een cruciale weerslag op de structuur en functie van de betrokken moleculen 4, 7, 8 heeft en vereist een uitgebreide chemische karakterisering 3 in het licht van de diverse biochemische gevolgen inbegrip van de service moleculaire klok van veroudering 9 .
Hoewel deamidering Asn residuen is relatief goed gekenmerkt door bottom-up shotgun proteomics 1, 10, deamidatie of Gln-residuen nog steeds geen geschikte karakteriseringsmethode buiten de uitdagende analyse van modelverbindingen door elektronen radicaal fragmentatie 11. We hebben onlangs een nieuwe één dimensie shotgun proteomics strategie (LERLIC-MS / MS) 3 die gescheiden Gin en Asn deamidering isovormen uit complexe biologische monsters en modelverbindingen maakt in een enkele analyse. LERLIC-MS / MS is gebaseerd op de scheiding van de tryptische peptiden gedigesteerd met behulp van een lange lengte (50 cm) ionenuitwisselingskolom (LAX) aan elektrostatische afstoting-hilic (Erlić) stand en gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (LC MS / MS). Deze nieuwe analytische strategie is toegepast voor het karakteriseren en kwantificeren betrekkelijk de omvang van elk gedeamideerd residuen in humane hersenweefselsf "> 3. Niettemin zal de hier geschetste protocol videobeelden van LERLIC-MS / MS doel de eigenaardigheden van eiwitdeamiderende bestuderen de biochemische context van belang.
ETHISCHE UITSPRAAK
Alle procedures van dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Nanyang Technological University in Singapore en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
In deze video-artikel geven we een stap-voor-stap protocol van LERLIC-MS / MS 3, een werkwijze om diepgaande karakterisering voeren en nauwkeurig de mate van proteïne deamidering en enzymatische processen dit eiwitmodificatie. LERLIC-MS / MS is gebaseerd op het gebruik van een lange lengte (50 cm) LOS volgens het elektrostatische repulsie-hilic (Erlić) 27. Het gebruik van een lange-kolomlengte, zoals in onze studie 3, maximaliseert het potentieel …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Singapore ministerie van Onderwijs (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Medical Research Council van Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) en NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). We willen graag onze dankbaarheid en meest oprechte dank aan Dr. Andrew Alpert en PolyLC team uit te drukken voor vriendelijk voorzag ons van het verpakkingsmateriaal dat mogelijk deze studie gemaakt.
PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |