조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.
일렉트로 포 레이션 (Electroporation)은 닭 배아와 같은 생물학적으로 관련된 생물체에 관심있는 유전자를 도입하는 방법입니다. 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본적인 생물학적 기능을 연구하기위한 효과적인 연구 모델이라는 것이 오랫동안 입증되어왔다. 보다 최근에, 닭 배아는 청력과 관련된 유전자 발현, 조절 및 기능을 연구하는데 특히 중요하게되었다. 귓볼에서 일렉트로 포 레이션은 고도로 전문화 된 청각 기능을 담당하는 청각 뇌간 영역을 표적으로하는 데 사용될 수 있습니다. 이 지역은 닭 핵 magnocellularis (NM)과 핵 laminaris (NL)을 포함합니다. NM 및 NL 뉴런은 rhombomeres 5 및 6 (R5 / R6)의 별개의 전구체로부터 발생합니다. 여기, 우리는이 지역에서 유전자 관련 특성을 연구하기 위해 플라스미드로 암호화 된 유전자의 비켜 일렉트로 포 레이션을 제시한다. 우리는 기능적 표현형의 증가 또는 감소를 촉진시키는 유전자 발현의 공간적 및 일시적 제어 방법을 제시한다es. R5 / R6와 연관된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써, 우리는 NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염을 나타낸다. 유전자 발현의 일시적인 조절은 tet-on 벡터 시스템을 채택함으로써 성취 될 수있다. 이것은 doxycycline (Dox)의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다. 생체 화학, 약리학 및 생체 내 기능 분석과 함께 in ovo electroporation 기술은 청각 신경 세포 발달 및 관련 병리 생리 현상을 연구하는 혁신적인 방법을 제공합니다.
소리의 빠른 신경 부호화는 정상적인 청각 기능에 필수적입니다. 여기에는 음향 국소화 능력 1 , 잡음 차별 2 에서의 발언 및 다른 행동 관련 통신 신호 이해 3이 포함 됩니다. 조류와 포유류 모두의 청각 뇌간에 위치한 유사 뉴런은 빠른 신경 엔코딩을 전문으로합니다 4 . 이들은 닭 핵 magnocellularis (NM), 핵 laminaris (NL) 및 그들의 포유류 유사체, anteroventral 달팽이관 핵 (AVCN) 및 중간 우수한 올리브 (MSO), 각각 5 . 그러나, 빠른 신경 부호화를 조절하는 발달 기전은 청각 뇌간에서 잘 이해되지 못한다. 따라서 au에서 발현, 조절 및 기능을 더 잘 이해하기 위해서는 빠른 신경 엔코딩을 담당하는 특정 유전자를 연구하는 것이 유리하다ditory 개발.
개발중인 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본 생물학적 질문을 연구하는 효과적이고 잘 정립 된 연구 도구이다. 최근의 분자 진보는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 을 분석하기 위해 관심있는 유전자를 발현하거나 파괴함으로써 닭 배아를 개발하는 생물학적 문제를 해결했습니다. 특정 유전자의 규제 역할을 조사하는 것은 청각 적 결핍과 관련된 병리학을 이해하는 데 중요한 진보입니다. 여기, 우리는 빠른 신경의 소리의 인코딩이 발생 치킨 청각 brainstem에 플라스미드 인코딩 유전자의 비켜 electroporation에 제시 10 . rhombomeres 5 및 6과 관련된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써 11 , 12 (R5 /R6), NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염의 공간 제어를 나타낸다. 또한, tet-on 벡터 시스템을 채택하여 표현의 시간적 조절을 보여줍니다. 이것은 doxycycline (Dox) 8 의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다.
비켜에서 electroporation는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 를 분석하기 위해 관심 유전자를 표현하거나 노크하는 방법입니다. 닭 배아에서, 그것은 다른 청각 brainstem 지역 8 로 플라스미드 인코딩 유전자를 표현하기위한 혁신적인 방법입니다. 최적의 발현을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 첫째, otocysts 명확하게 볼 …
The authors have nothing to disclose.
우리는 Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria 및 Mrs. Ximena Optiz-Araya와 협력하여 프로토콜 설정 및 플라스미드 제공에 대한 초기 지원을 받았습니다. 이 작품은 NIH / NIDCD 교부금 DC013841 (JTS)에 의해 지원되었다.
Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |