I Ovo Electroporation i Kylling Auditory Brainstem

Summary

Auditoriske hjernestammenes neuroner av avians og pattedyr er spesialisert på rask nervekoding, en grunnleggende prosess for normale hørefunksjoner. Disse nevronene oppstår fra tydelige forløperne av embryonale hindbrain. Vi presenterer teknikker som benytter elektroporasjon til å uttrykke gener i hindre av kyllingembryoer for å studere genfunksjon under auditiv utvikling.

Abstract

Elektroporation er en metode som introduserer gener av interesse for biologisk relevante organismer som kyllingembryoen. Det er lenge fastslått at kyllingembryoen er en effektiv forskningsmodell for å studere grunnleggende biologiske funksjoner for lydsystemutvikling. Mer nylig har kyllingembryoen blitt spesielt verdifull i å studere genuttrykk, regulering og funksjon forbundet med hørsel. I ovo kan elektroporasjon brukes til å målrette auditiv hjernestamregion som er ansvarlig for høyt spesialiserte hørselsfunksjoner. Disse områdene inkluderer kyllingekernen magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL). NM- og NL-neuroner oppstår fra tydelige forløpere av rombomerer 5 og 6 (R5 / R6). Her presenterer vi i ovo elektroporation av plasmidkodede gener for å studere genrelaterte egenskaper i disse regionene. Vi viser en metode for romlig og tidsmessig kontroll av genuttrykk som fremmer enten gevinst eller tap av funksjonell fenotypees. Ved å målrette auditoriske neurale progenitorregioner assosiert med R5 / R6, viser vi plasmidtransfeksjon i NM og NL. Temporal regulering av genuttrykk kan oppnås ved å vedta et tet-on-vektorsystem. Dette er en legemiddelinducerbar prosedyre som uttrykker genene av interesse i nærvær av doxycyklin (Dox). I ovo elektroporasjonsteknikken – sammen med enten biokjemiske, farmakologiske og eller in vivo funksjonelle analyser – er det en nyskapende tilnærming til å studere lydutvikling og tilhørende patofysiologiske fenomener.

Introduction

Rask neural koding av lyd er viktig for normale lydfunksjoner. Disse inkluderer lyd lokaliseringsevner ¹ , tale i støy diskriminering ² , og forståelsen av andre adferdsrelevante kommunikasjonssignaler ³ . Analoge nevroner som er lokalisert i den hørbare hjernestammen til både avianer og pattedyr, er høyt spesialiserte for rask neural koding ⁴ . Disse inkluderer kyllingekernen magnocellularis (NM), nucleus laminaris (NL) og deres pattedyranaloger, den anteroventrale cochleære kjernen (AVCN) og den mediale overlegne oliven (MSO) henholdsvis ⁵ . Imidlertid er utviklingsmekanismer som regulerer rask nervekoding, dårlig forstått i den hørbare hjernestammen. Derfor er det fordelaktig å studere spesifikke gener som er ansvarlige for rask nervekoding for å bedre forstå deres uttrykk, regulering og funksjon i auSykdomsutvikling.

Den utviklende kyllingembryoen er et effektivt og veletablert forskningsverktøy for å studere grunnleggende biologiske spørsmål om lydsystemutvikling ^{6 , 7} . Nylige molekylære fremskritt har adressert disse biologiske spørsmålene i det utviklende kyllingembryoen ved å uttrykke eller slå ned gener av interesse for å analysere in vivo genfunksjon ^{8 , 9} . Undersøkelse av regulerende rolle av spesifikke gener er en betydelig fremgang i forståelse av patologier forbundet med auditiv underskudd. Her presenterer vi i ovo elektroporasjon av plasmidkodede gener inn i kylling-auditiv hjernestammen, hvor rask nervekoding av lyd forekommer ¹⁰ . Ved å målrette auditiv nevrale progenitorregioner assosiert med rombomerer 5 og 6 ^{11 , 12} (R5 /R6), viser vi romlig kontroll av plasmidtransfeksjon i NM og NL. I tillegg viser vi temporal regulering av uttrykk ved å vedta et tet-on vektorsystem. Dette er en medisininducerbar prosedyre som uttrykker genene av interesse i nærvær av doxycyklin (Dox) ⁸ .

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av Institutt for dyrepleie og brukskomiteer fra Northwestern University, og utført i samsvar med National Institutes of Health Retningslinjer for pleie og bruk av laboratoriedyr. 1. Egghåndtering Kjøpt befruktet egg fra en lokal leverandør. Oppbevar egg ved 13 ° C i kjøleskap i ikke mer enn 5 dager før inkubering. Livskraften i embryoen minker betydelig etter 1 uke. Vask hvert egg med 70% etanol før du setter inn i inkubatoren. <…

Representative Results

Vi viser her at i ovo elektroporation tillater genuttrykk i et normalt utviklende biologisk system. Plasmidkodede gener injiseres fokalt i nevrale røret som ligger over R5 / R6. Et skjematisk eksempel på elektroden og pipettplasseringene i forhold til viktige anatomiske markører er vist i figur 1A . Den korrekte plassering av plasmidinjeksjon bekreftes 24 timer etter elektroporasjon og vist i figur IB . Den målrettede injeksjonen av plasmide…

Discussion

I ovo elektroporation er en metode for å uttrykke eller slå ned gener av interesse for å analysere in vivo genfunksjon ^{8 , 9} . I kyllingembryoen er det en nyskapende metode for å uttrykke plasmidkodede gener i forskjellige auditive hjernestammeområder ⁸ . For å sikre optimal uttrykk, er det nødvendig med flere kritiske trinn. Først injiser bare embryoer hvis otocystene er tydelige. Hvis otocytter ikke er synlige,…

Materials

Fertilized white leghorn chicken eggs	Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator	Grass Technologies	SD9	SD9
Microfil syringe needles	World Precision Instruments	MF28G67-5	28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder	Warner Instruments	64-1280	MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode	FHC	PBSA1075	PBSA1075
Air tank/regulator	NU Laboratory Services		Air dry 300 CF
Fast green	Sigma Aldrich	F7258-25G	F7258-25G
Clear plastic tape	Scotch	191
Doxycycline hyclate	Sigma Aldrich	D9891-1G
Egg refrigerator	Vissani Wine Refrigerator		13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator	Hova-Bator		37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope	Zeiss	4.35E+15	SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source	Zeiss	4.36E+15	CL6000 LED
Micromanipulators	Narishige Japan	Model: MM-3	2 Micromanipulators
Capillary tubes	Sutter Instrument	BF150-86-10	Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes			1 mL, 3 mL
Needles	BD Precision Glide		27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps	Stoelting		No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder	Custom Made		Clay base works as well
Micropipette puller	Sutter Instrument		Model P-97
Syringe filter	Ultra Cruz	sc-358811	PVDF 0.22 μm