जैविक नमूने से कैंसर के स्टेम सेल का पता लगाने और शुद्ध करने के लिए डीएनए डाई ट्रिगर साइड पॉप्युलेशन फीनोटाइप का उपयोग
Summary
जैविक नमूनों से स्टेम सेल आबादी के लक्षण वर्णन और अलगाव की अनुमति देने के तरीके कैंसर और उससे आगे के स्टेम सेल-लक्षित उपचार की अग्रिम के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहां, हम डाई-ट्रिगर किए गए पक्ष जनसंख्या फेनोटाइप का उपयोग करके कैंसर स्टेम सेल अलगाव के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Abstract
कैंसर एक स्टेम कोशिका-प्रेरित रोग है और इन कोशिकाओं का उन्मूलन एक प्रमुख चिकित्सीय लक्ष्य बन गया है। कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) की कमजोरियों को समझना और उपयुक्त आणविक लक्ष्यों की पहचान करना उन तरीकों पर निर्भर करता है जो सेल लाइनों और पूर्व विवो ट्यूमर टिशू जैसे विषम नमूनों में उनके विशिष्ट भेदभाव की अनुमति देते हैं। फ्लो साइटोमैट्री / एफएसीएस एकल-सेल स्तर पर जैविक नमूनों का मल्टी-पैरामीट्रिक रूप से विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए लाइव कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए पसंद की विधि की तिथि है। सीडी 444 और सीडी 133 जैसी सतह के मार्करों के साथ-साथ एल्डिहाइड डीहाइड्रोजनेज़ एंजाइमैटिक गतिविधि का पता लगाने के लिए अक्सर एफएसीएस द्वारा ट्यूमर के नमूने से सीएससी को परिभाषित करने और निकालने के लिए उपयोग किया जाता है। एक पूरक दृष्टिकोण, जो कि विधिगत विस्तार में दर्शाया गया है, एबीसी दवा ट्रांसपोर्टरों द्वारा कार्यात्मक डाई एक्सट्रूज़न का उपयोग करता है, जो प्रतिदीप्ति-मंद कोशिकाओं की एक विशिष्ट आबादी को आम तौर पर पक्ष आबादी (एसपी) के रूप में संदर्भित करता है। सपाकैंसर कोशिकाओं में कैनोनिकल स्टेम कोशिका विशेषताओं का प्रदर्शन होता है और डाई-एक्स्ट्रूइडिंग ड्रग ट्रांसपोर्टर (प्रायः एबीसी बी 1 / पी-ग्लाइकोप्रोटीन / एमडीआर 1 / सीडी 243 और एबीसीजी 2 / बीसीआरपी 1 / सीडी 338) को रोकते हुए एजेंटों के उपयोग से इनकार कर दिया जा सकता है। इसके अलावा, एसपी परख अन्य प्रवाह cytometric मूल्यांकन के साथ संगत है जैसे सतह एंटीजन, एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनीज का पता लगाने और मृत सेल भेदभाव ( जैसे , 7-एएडी या प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ)। इस प्रकार, हम सीएससी की पहचान, अलगाव और उप-लक्षण वर्णन के लिए एक मूल्यवान और मोटे तौर पर लागू विधि का वर्णन करते हैं, जो एक फेनोटाइपिक पैरामीटर के बजाय एक कार्यात्मक पर आधारित है। यद्यपि मूलतः हईचस्ट 33342 के साथ ट्रिगरिंग डाई के साथ प्रदर्शन किया गया है, हम यहां पर हाल ही में वायलेट डाई आधारित एसपी फेनोटाइप पर ध्यान केंद्रित करते हैं जो वायलेट लेजर स्रोत से लैस किसी भी प्रवाह साइटोमीटर पर रिजोल्यूबल होता है।
Introduction
बीमारी के आनुवांशिक और आणविक समझ में मजबूती के कारणों और चिकित्सीय एंटीबॉडी और छोटे अणु अवरोधकों जैसे लक्षित दवाओं के आगमन के कारण पिछले दशक में प्राथमिक कैंसर उपचारों की प्रभावोत्पादकता में काफी सुधार हुआ है। इसके विपरीत, मेटास्टैटिक और आवर्तक रोग अभी भी सामान्य रूप से असाध्य होते हैं, और इन नैदानिक सेटिंग्स में रोग और मृत्यु दर उच्च रहती है। सीएससी ट्यूमर के भीतर एक पृथक उप-लोकोत्पादन का प्रतिनिधित्व करते हैं और क्लॉनोजेसिटी / ट्यूमोरिजेनिसिटी, मल्टी ड्रग प्रतिरोध और असममित सेल डिवीजन 1 , 2 जैसे कैनोनिकल स्टेम सेल गुणों के साथ संपन्न होते हैं। इस प्रकार, सीएससी न केवल मेटास्टेटिक प्रगति और ट्यूमर विविधताएं संचालित करते हैं, बल्कि उपचार के दौरान रोगी को पुनरुत्थान करने के लिए प्राथमिकता भी करते हैं। इसलिए चिकित्सीय सीएससी उन्मूलन, रोग की आवृत्ति को रोकने और कैंसर के दीर्घकालिक इलाज की अनुमति देने के लिए एक महत्वपूर्ण चिकित्सा आवश्यकता है </sup>।
सीएससी को समाप्त करने के लिए कमजोरियों और रणनीतियों की पहचान भारी तरीके से उस तरीके पर निर्भर करती है जो बाद में अभिव्यक्ति प्रोफाइल और / या कार्यात्मक जांच के लिए जैविक नमूने से अपने शोधन की अनुमति देते हैं। बदले में, इस तरह के तरीकों सतह पर निर्भर, intracellular या कार्यात्मक मार्करों जो इन कोशिकाओं के लिए विशिष्ट हैं। सीएससी-विशिष्ट सतह मार्करों में सीडी 44, सीडी 133, सीडी 24 और सीडी 9 0 शामिल हैं, लेकिन इन तक सीमित नहीं हैं, और स्तन कैंसर और कोलन कैंसर 4 सहित विभिन्न ट्यूमर संस्थाओं में सीएससी जनसंख्या की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है। एक अन्य मार्कर, एल्डिहाइड डेहाइड्रोजनेज (एएलडीएच), इंट्रासेल्युलर लोकेशन को दिखाता है और कार्यात्मक रूप से एक संबंधित सब्स्ट्रेट प्रदान कर सकता है जिसका एंजाइमिक रूपांतरण प्रकाश उत्पन्न करता है। इस परीक्षण का उपयोग करते हुए, सीएससी की आबादी विभिन्न ट्यूमर संस्थाओं में भी पहचान की गई है। एक पूरक पद्धति, जिसे आमतौर पर एसपी विश्लेषण के रूप में संदर्भित किया जाता है और इसे एम में चित्रित किया जाता है एडीसी दवा ट्रांसपोर्टरों द्वारा प्रतिदीप्ति-मंद स्टेम जैसी कोशिकाओं 6 , 7 , 8 की छोटी आबादी की पहचान करने के लिए ethodological विस्तार, सक्रिय डाई फ़िलक्स का उपयोग करता है। इसे प्राप्त करने के लिए, एक दिया नमूना लाइपोफिलिक डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोफोरे की उपस्थिति में होता है जो निष्क्रिय कोशिकाओं के माध्यम से सभी कोशिकाओं में प्रवेश करता है और बाइंडिंग के लिए परमाणु और मिटोकोन्ड्रियल डीएनए को लक्षित करता है। एबीसी ड्रग ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति से रहित गैर-सीएससी, उज्ज्वल प्रतिदीप्ति के परिणामस्वरूप डाई को संचित करते हैं, जबकि सीएससी सक्रिय रूप से डाई को बाहर निकालती है जो प्रतिदीप्ति को कम करता है। औषध ट्रांसपोर्टर गतिविधि के औषधीय निषेध का निषेध और कार्यात्मक रूप से एसपी फेनोटाइप की पुष्टि करता है और नियंत्रण उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। एसएस विशेषताओं का प्रदर्शन सीएससी जनसंख्या दूसरों के बीच, डिम्बग्रंथि के कैंसर 9 , 10 , प्रोस्टेट कैंसर में प्रकट किया गया है 11 ,> 12, स्तन कैंसर 13 , फेफड़ों के कैंसर 14 , एंडोमेट्रियल कैंसर 15 , ग्लियोमा 16 , 17 और हड्डी सरकोमा 18 । महत्वपूर्ण रूप से, एसपी परख कैंसर सेल लाइनों और प्राथमिक ट्यूमर के ऊतक दोनों के साथ संगत है, भले ही प्राथमिक सामग्री में अतिरिक्त चुनौतियों का सामना करना पड़ता है जैसे कि एक विशिष्ट ट्यूमर सेल भेदभाव रणनीति (कुछ होस्ट सेल आबादी एसपी विशेषताओं को भी प्रदर्शित कर सकती है) की आवश्यकता 19 , 20 ।
दो सबसे स्थापित एसपी-परामर्शदाता दवा ट्रांसपरेटर एबीसीबी 1 / पी-ग्लाइकोप्रोटीन / एमडीआर 1 / सीडी 243 और एबीसीजी 2 / बीसीआरपी 1 / सीडी 338 8 , 9 , 21 ; हालांकि, अन्य दवा ट्रांसपोर्टर एसपी फेनोटाइप के एक आणविक निर्धारक भी हो सकते हैं ( जैसे , एबीसीबी 5) 22 । ABCB1एआरसीजी 2 की क्रियाकलाप विशेष रूप से फूमिट्रेमोरगिन सी (एफटीसी) 6 , 1 9 के साथ समाप्त कर दिया जा सकता है, जबकि वेरामिमिल के साथ कुशलतापूर्वक अवरुद्ध किया जा सकता है। एसपी विश्लेषण की एक विशेष ताकत यह है कि इसे अन्य डाइनियों ( जैसे , सतह के मार्करों और एएलडीएच) के साथ जोड़ा जा सकता है और इससे लाइव सेल रिकॉर्ड्स इस प्रकार डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक जांच के साथ संगत है। इसके अलावा, सीएससी जनसंख्या 9 , 23 के बीच एबीसी औषध ट्रांसपोर्टरों के उच्च संरक्षण के कारण एसपी का पता लगाने का मोटे तौर पर उपयोग होता है।
मूल रूप से, हेपस्ट 33342 का इस्तेमाल ट्रिगरिंग डाई 24 के रूप में एसपी का पता लगाया गया है। यह डाई उत्कृष्ट समाधान प्राप्त करता है लेकिन पराबैंगनी लेजर उत्तेजना की आवश्यकता होती है; इसलिए इसकी प्राप्यता स्वाभाविक रूप से उच्च अंत प्रवाह साइटोमेट्रिक उपकरणों तक सीमित है। डाईइकाईकल वायलेट (डीसीवी) 25 के आगमन ने नए एवेन्यू खोल दिए हैंएसपी के विश्लेषण के लिए एसएस और इस विधि की प्रयोज्यता को मानक प्रवाह के लिए एक अल्ट्रावियोलेट लेजर स्रोत (एक वायलेट लेजर स्रोत डीसीवी-एसपी कोशिकाओं को हल करने के लिए पर्याप्त) की कमी वाले साइटमॉमिक उपकरणों को बढ़ाया। महत्वपूर्ण रूप से, होच्स्ट 33342 और डीसीवी सामान्य पंप विशिष्टताओं को साझा करता है, यह दर्शाता है कि या तो रंग एक ही सेल आबादी की पहचान करनी चाहिए।
यहां, हम स्वतंत्र प्रयोगशालाओं में त्वरित और आसान प्रजनन के लिए डीसीवी आधारित एसपी विश्लेषण के एक विस्तृत प्रायोगिक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम इस प्रकार हमारे लेख को सीएससी शोधकर्ताओं के लिए संसाधन के रूप में मानते हैं जो इस उपयोगी सेल-जैविक विधि के अनुकूलन और मानकीकरण में योगदान करना चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैंसर के नैदानिक प्रबंधन में प्रगति, सीएससी को लक्षित करने वाले उपचार विधियों के विकास पर भी निर्भर करता है। जैविक नमूनों से सीएससी के विश्वसनीय अलगाव की अनुमति देने के तरीके उपयुक्त लक्ष्य की पहचा…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
मैक्सिमिलियन बोशेर् को ऑस्ट्रियन साइंस फंड एफडब्ल्यूएफ (अनुदान संख्या जे -3807) की एर्विन श्रोडिंगर फेलोशिप द्वारा समर्थित है।
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
Referências
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