Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.
Otofaji, büyüme ve farklılaşma esnasında biriken normal veya işlevsel olmayan hücresel bileşenlerin lizozom ile parçalanması ve geri dönüşüme tabi tutulduğu katabolik bir yoludur. Otofaji sırasında, sitoplazmik LC3 proteini lipidize edilir ve otofagosomatik membranlara işe alır. Otofagozom daha sonra autosfosome vezikülün parçalanması ve içeriğinin bulunduğu otolizozomu oluşturmak için lizozom ile birleşir. LC3'e bağlanan ubiquitin ile ilişkili protein p62, otofajik akıyı izlemek için de kullanılır. Otofajyondan geçen hücreler, p62, LC3 ve lizozomal belirteçlerin birlikte lokalizasyonunu göstermelidir. İmmünofloresan mikroskobu, LC3 punktasını, p62'yi ve / veya lizozomları hücre başına bazında görsel olarak tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, objektif ve istatistiksel olarak titiz bir değerlendirme yapmak zor olabilir. Bu problemlerin üstesinden gelmek için multispektral görüntüleme akım sitometrisi ve parlak de-Üç otofaji belirteçlerinden (LC3, p62 ve lizozomal LAMP1) kuyruk görüntüleri üretir ve otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için LC3 nokta sayımı ile kombinasyon halinde birlikte lokalizasyonunu nicelendirir.
Bundan sonra otofajinin olarak anılacaktır Macroautophagy, zarar görmüş ya da işlevsel parçalar, uzun ömürlü proteinler ve organeller lizozom ile parçalanan ve 1 geri dönüştürülür edildiği bir katabolik geçiş yoludur. Otofaji, bir otofagosom oluşumunu içeren dinamik, çok aşamalı bir süreçtir; Otoflikozomun lizozom ile kaynaşması, otolizozomun oluşturulması; Ve otolizozomun içeriğinin bozunması 2 . Membran sistemlerinde otofajiyi tanımlamak için kullanılan kritik biyolojik belirteç otofajozomal membranı oluşturan mikrotübüle bağlı protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) 'dur. Otofaji sırasında sitosolik LC3-1, LC3-II oluşturmak üzere fosfatidiletanolamine konjüge edilir; Daha sonra LC3-II, otofajozomal zar 3 içine dahil edilir. Otofajik akı için yaygın olarak kullanılan bir diğer marker, otofaj reseptör sekestozomu 1 (SQSTM1, p62) olup, bunlar fiziksel olarak liAutophagic membran 4 , 5'e otofajik yük getirir.
Geleneksel olarak otofajiyi ölçmek için kullanılan yöntemler Western lekeleri ve floresan mikroskobu 7'dir . Ancak bu yöntemlerin hiçbirinin "altın standart" olarak kabul edilir 2, bu tekniklerin her ikisi ile ilişkili zorluklar vardır 6 olarak. Western lekeleri ortalama verir çünkü homojen bir örnek kullandıklarından, gözlemciler tek tek hücrelerde neler olduğunu göremezler. Öte yandan, flüorür mikroskobu, tek hücre seviyesinde bir gözlemci bilgi verir, ancak, objektif ve istatistiksel olarak titiz değerlendirmelerin elde edilmesini zorlaştıran üretim kapasitesinden yoksundur. Son yıllarda, multispektral görüntüleme akış sitometrisi (MIFC, Malzeme Tablosuna bakınız) ile LC3 ve p62 ölçümü popülasyon kazanmaktadırNiceliksel gücü, yüksek işleme kapasitesi, çoklama potansiyeli ve her hücrenin imajını oluşturma yeteneği nedeniyle çok sayıda. Otofaji kendi kendine analiz yazılımıyla (bkz . Malzemelerin Tablosu ) birlikte kullanarak otofajiyi ölçmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biri, LC3 punktasının veya otofagozomların 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14'ün nokta sayımı yoluyla yapılır , 15 , 16 , 17 . Bununla birlikte, otofagozomlarda bir artış, mutlaka, otofajide bir artış olduğu anlamına gelmez çünkü süreçte bir blokaj da gösterebilir 2 . LC3-II cirosu, varlıklardaki hücreleri analiz ederek otofajik akıyı ölçmek için yararlı bir parametredir veKlorosin gibi bir lizozomal bozunma önleyicisinin bulunmaması. Klorokuin, böylece 18 oluşabilir lizozomal bozulması önce otofajik akı durdurulması ile otofajinin derecesinin bir ölçüsü olarak, otofagozom oluşumunun miktarının belirlenmesine izin veren lizozoma otofagozom füzyonunu inhibe eder. Buna ek olarak, p62 öncelikle otofaji ile bozundur ve otofagozomun ve içeriğinin lizozomal parçalanması engellendiğinde, p62'nin birikimi 17 , 19 olması beklenir.
Otofaji çok aşamalı bir süreçtir ve LC3 veya p62'nin tek başına ölçümü, hücrelerde olup bitenenin tam bir resmini vermez. Yakın tarihli yayınlar, otolizozomun eşzamanlı oluşumunu inceleme ihtiyacını vurgulamıştır 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 – lizozom 15 otofagozom ko-lokalizasyonunu görüntüleme ile autolysosome oluşumunu ölçmek için benzersiz mümkün. Buna ek olarak, P62 ve MIFC kullanılarak LC3 eş yerleşimi de otofajik akı 5 ölçmek için incelenmiştir. Referans analiz yazılımında, birlikte yerelleştirmeyi ölçen "özellik", "Parlak Detay Benzerliği R3" (BDS) olarak adlandırılır ve iki görüntünün küçük, parlak görüntü ayrıntılarını karşılaştırmak için özel olarak tasarlanmıştır. BDS, 3 piksel veya daha düşük bir yarıçapa sahip lokalize parlak noktaların log dönüşümlü Pearson korelasyon katsayısıdır; Başka bir deyişle, BDS hesaplar o derecesiİki farklı flüoresan kanalından pikseller verlapping. Parlak noktalar ya birbiriyle ilişkilendirilir (diğer bir deyişle, aynı uzaysal konum) veya ilişkisizdir ( yani, farklı uzaysal yerler). Bu nedenle korelasyon katsayısı 0 (korelasyonsuz) ile 1 (mükemmel korelasyon) arasında değişir. Katsayı aralığı sıfırdan sonsuza 26 , 27'ye çıkarmak için log dönüşümlüdür. BDS tek başına yeterli olmayabilir; Rajan ve ark. Sadece BDS'nin kullanılması yanlış-pozitif veya yanlış-negatif sonuçlara neden olabileceğini bulmuştur 21 . BDS, otofajinin iki belirteçinin birlikte lokalizasyonunu değerlendirir, ancak otofagozom sayısını dikkate almaz. Otofagozom sayısını açıklamak için Rajan ve ark. LC3 puncta 21'in nokta sayımını içermektedir. Rajan ve ark. BDS'ye karşı LC3 nokta sayımının bir iki değişkenli dağılım grafiğini kullanarak önerdi. Bu iki değişkenli arsa kullanılarak iki popülasyonİlk tanımlanan: biri yüksek seviyede LC3 lekelerine sahip hücreler ve diğeri düşük seviyeli LC3 lekelerine sahip hücreler. Yüksek eş-lokalizasyonu (yani otolizozomlara birikmesi), düşük (diğer bir deyişle, otofagozomların birikmesi) eş-lokalizasyonu ve hücreler ile hücrelerin: Yüksek LC3 nokta popülasyonu ayrıca iki popülasyona sınıflandırılmıştır. Bu iki değişkenli arsa, az sayıda otofagozomlu hücreler ile otofagozom birikimi ve / veya otolizozomlar 21 olan hücreleri ayırt etmeyi sağlar.
Şimdiye kadar, LC3, p62 ve LAMP1'in (lizozomal markör) eş zamanlı birlikte lokalizasyonu, MIFC tamamlayıcı analiz yazılımında tek bir "Özellik Türü" kullanarak mümkün değildi (Malzeme Tablosuna bakın). Bununla birlikte, kısa süre önce 6.1 sürümünde tanıtılan yeni bir özellik, Parlak Ayrıntı Ayrıntılı Yerleştirme 3 (BDC3) olarak adlandırılır. BDC3, üç görüntünün her birinden parlak ayrıntı resimlerini karşılaştırır (bu durumda, LC3, p62 ve LAMP1) ve üç sondanın birlikte lokalizasyonunu niceleştirir ( yani, LC3, p62 ve LAMP1). BDC3 özelliği, Pearson korelasyon katsayısını üç görüntüye kadar genişletmek için hesaplar. Üç görüntünün parlak noktaları ya korelasyonlu ya da korelasyonsuz olduğundan, korelasyon katsayısı 0 (korelasyonsuz) ile 1 (mükemmel korelasyon) arasında değişir. Katsayı, 0 ile sonsuz arasındaki dinamik aralığı arttırmak için günlüğe dönüştürülür. BDS özelliğini BDC3 özelliğiyle değiştirerek, Rajan ve ark. Tarafından sunulan analiz yöntemi, Autophagy'yi aynı anda bir sistemde ölçmek için en çok kullanılan üç markörü bir araya getirebilir. Otofajinin bu üç belirteçinin tek bir deneyde birlikte lokalize edilmesi, otofajinin indüksiyonunda ve düzenlenmesinde yeni anlayışlara yol açabilir. Aşağıdaki protokol, Jurkat hücrelerinde otofaji indirecek adımları özetlemektedir; Hücreleri LC3, p62 ve LAMP1 antikorları ile etiketleyin; Multisp hakkında veri edininEktral görüntüleme akış sitometresi; Ve otofajik akıyı değerlendirmek için verileri analiz eder.
Bu analiz yapılırken göz önüne alınması gereken birkaç nokta var. Uygun kontrol örneklerine sahip olmak önemlidir. Bu deney için iki farklı kontrol kullanıldı: Kontrol ve Kontrol + Klorokin. Bölgeler için eşik değeri belirlemek için Kontrol örneği kullanıldı. Otofajinin temel seviyesini lizozomal bozunmayı durdurmadan gösterir ve Starved örneğinin kontrolüdür. Bununla birlikte, Kontrol örneği, Starved + Chloroquine örneğindeki sonuçlar ile karşılaştırmak için uygun bir kontrol değildir; çünkü klorokin kontrol numunesini etkiler. Dolayısıyla, bir Control + Chloroquine örneği almak gerekiyordu.
Otofaj için herhangi bir analiz yapmadan önce, yalnızca odaklanan tek hücre ( yani, RMS, 60'dan büyük gradyan) üzerinde analiz etmek / kapamak önemlidir, çünkü birden fazla hücre varsa veya görüntüler etkilenebilir odak dışı. OtofagosomunEs ve lizozomlar uygun nokta sayımı ve BDC3 analizi için odaklanmaktadır. Otofaji analizinden önce apoptotik hücreler çıkartılmalıdır, çünkü sonuç çarpıtabilir ve eklenmemelidir. Her üç belirteç için de uygun boyama yapılmalıdır ( yani, LC3, p62 ve LAMP1). Örneğin, üç belirteçin tümü hücrelerarasıdır ve noktalamalı bir işaret içermelidir; Sinyal işaretli değilse veya hücrenin yüzeyinde bulunuyorsa boyama uygun olmayacak ve deney / boyanma yeniden yapılmalıdır. Buna ek olarak, BDC3'ün doğru olması için, ilgilenilen üç flüoresan markeri için parlak olan hücreleri kaplamak gereklidir. Olumlu olaylar üzerinde geçiş, BDC3'ün spesifik olmayan bağlanma, görüntüleme eserleri ve / veya gürültü üzerindeki ölçümünü önlemek için gereklidir. BDC3, gerçek sinyaller olmayan eserleri potansiyel olarak artırabildiği için bu çok önemlidir. BDC3 yalnızca parlak olumlu olaylar üzerinde gerçekleştirilebildiğinden, birçok hücre son analizde yer almayabilir; Bu especLC3, p62 ve / veya LAMP1 birikimine sahip olmayan kontrol hücreleri için geçerlidir. Bu nedenle, bu tahlilde bir sınırlama, BDC3'ün yalnızca üç markör için de pozitif olan hücreleri inceler, bu da tüm otofajy deneyleri için uygun olmayabilir.
Daha önce 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 olarak bildirilen BDS gibi, BDC3 tek başına, birlikte lokalize olan otofaji organellerin sayısını hesaba katmaz, bu da büyük bir dereceye neden olur Otofagozom sayısındaki değişkenlik. Bu nedenle, Rajan ve ark. Tarafından sunulan iki değişkenli yaklaşım ; kullanılmıştır. İki değişkenli parsele baktığımızda,Hücreler LC3, p62 ve LAMP1 için pozitif olmalıdır; Neden 0 noktalı çok fazla hücre var? Bunun nedeni, LC3 sinyalinin birlikte lokalizasyon için yeterince parlak olabilmesidir, ancak bunun dikkate alınması için gerekli olan tepe maskesinin (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4)) belirlediği eşiğe gelmeyebilir yer.
Burada sunulan protokol, otofajik akıyı ölçmek için LC3 noktalamasını saymak için MIFC'yi ve üç otofaji belirteçinin birlikte lokalizasyonunu kullandı. Bazal şartlar altında (kontrol örneği), otofagozom sayısı düşük ve "Yüksek Noktalar" ile çok az hücre bulundu. Otofagozom / lizozom füzyonunu inhibe eden klorokin ilavesi ile LC3 lekelerinin sayısında bir artış olmuştur. Lizozom otofagozomu ve otofagozomda bulunan p62'yi parçalayamadığından, LC3, p62 ve LAMP1 otolizozom birikiminin birlikte lokalizasyonunda artışa neden olur. Bu etki, besleyici starvatIyon, otofajiye neden olur. Bununla birlikte, klorokin ilavesi olmaksızın, büyük olasılıkla otofajik döngü oranındaki artıştan ötürü otofogozom sayısındaki belirgin bir artış görülmemiştir. Hücreler klorokin varlığında aç bırakıldığında, açlığın otofajik akıyı arttırdığı sonucunu destekleyen otofagozomların birlikte lokalizasyonunda ve sayısında bir artış oldu. EBSS, otofajinin güçlü bir uyarıcısı olarak bilinir. Dolayısıyla, artışın büyük olması bekleniyor. Otofajiyi indüklemek için uyuşturucu indüksiyonu gibi başka bir yöntem kullanılırsa, kontrol ve muamele edilmiş numuneler arasındaki fark daha ince olabilir.
Bu özel protokol, insan hücre dizilerindeki otofajiyi ölçmek üzere tasarlanmıştı, ancak tahlil, bu türler için antikora geçiş yaparak diğer türlere adapte edilebilir. Buna ek olarak, analiz yöntemi, birlikte lokalizasyonu gerektiren herhangi bir hücre içi uygulama için kullanılabilirÜç prob / belirteçten oluşur.
The authors have nothing to disclose.
MilliporeSigma, Philip J. Morrissey ve Sherree L. Friend'deki meslektaşlarımıza yıllar boyunca destek ve rehberlik yaptıkları için teşekkür etmek istiyorum. Vidya Venkatachalam'a ve Bryan R. Davidson'a, IDEAS yazılımındaki BDC3 özelliği ile ilgili yardımlarından ötürü teşekkür ediyorum , bu el yazması için Raymond Kong'a yardımcı olmak için Ryan P. Jessup çekim gününde yardım ve özel teşekkürler Makyaj sanatçısı Cynthia Xamonthiene'e.
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
AF647 labeled Donkey anti-Mouse – IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] – Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
DAPI Stain 5mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain—CAS-28718-90-3—Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10X | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
Earle's Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14155 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14175 | |
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
MIFC software – INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | HyClone | SV30082.1 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
Sodium Pyruvate solution (100mM) | HyClone | SH30239.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered—CAS-9002-93-1—Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |