蛋白质tRNA琼脂糖凝胶延迟测定分析<em>ñ</em<sup> 6</sup> - 磺酰氨基甲酰腺苷TcdA功能
Summary
介绍了通过琼脂糖凝胶阻滞测定技术生产tRNA（UUU）和tDNA（UUU）与酶TcdA复合物的分析方案。
Abstract
我们展示了在大肠杆菌中表达和纯化tRNA（UUU）的方法，并且通过凝胶阻滞测定法分析tRNA（UUU）与TcdA（ N 6 –苏氨酰氨基甲酰氨基腺苷（t6A）脱水酶）的结合的分析，其使苏氨酰氨基甲酰基侧链连接到tRNA的反密码子茎环（ASL）中的A37到循环t 6 A（ct 6 A）。在具有1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）的大肠杆菌中诱导编码tRNA（UUU）的合成基因的转录，诱导后24小时收获含有tRNA的细胞。使用酸性酚提取法纯化RNA级分。通过凝胶过滤色谱法获得纯tRNA，其有效地将小尺寸tRNA分子与较大的完整或片段化的核酸分离。为了分析与tRNA（UUU）结合的TcdA，将TcdA与tRNA（UUU）混合，并在4℃下在天然琼脂糖凝胶上分离。游离tRNA（UUU）迁移更快，而TcdA-tRNA（UUU）复合物经历了在凝胶染色时可观察到的移动性延迟。我们证明TcdA是一种tRNA（UUU）结合酶。这种凝胶阻滞测定可用于研究TcdA突变体以及添加剂和其他蛋白质对结合的影响。
Introduction
凝胶阻滞测定1 （也称为电泳迁移率变动测定，EMSA）是设计用于研究和表征蛋白质 – 核酸相互作用的电泳方法。它允许使用纯化的组分或蛋白质（ 例如细胞裂解物）或核酸的复杂混合物（ 例如 ，tRNA）来分析蛋白质-DNA以及蛋白质 – RNA相互作用，特别是tRNA和tRNA结合蛋白质之间的相互作用池）。我们已经将凝胶阻滞测定法应用于纯化的tRNA（UUU）和TcdA（N6-磺酰基氨基甲酰基腺苷（t6A）脱水酶）之间相互作用的研究，该脱水酶使连接于A30的苏木糖氨基甲酰侧链在反密码子茎环（ASL）中环化，的tRNA到循环t 6 （ct 6 A） 2,3 。 TcdA也被称为CsdL 3 ，tcdA / csdL基因与csdA和csdE基因5形成簇，其编码半胱氨酸脱硫酶和半胱氨酸亚硫酸盐脱硫酸盐（CSD）系统的硫受体，并需要在体内维持TcdA功能3 。
凝胶阻滞测定的基本原理是，尽管游离核酸分子由于其大的负电荷而快速迁移到丙烯酰胺或琼脂糖凝胶的前部，但是相同核酸的蛋白质复合物的电泳迁移率显着降低。迁移率的降低可视化为核酸 – 蛋白质复合物中的“转移”，其作为离散条带解决。带正电荷的和较大的核酸 – 蛋白质复合物在凝胶上显示出更大的移动或降低迁移率。
由于复合体的电荷中和是普遍现象对于蛋白质 – 核酸复合物，凝胶阻滞测定可以应用于广泛的复合物和核酸类型。该方法简单，价格便宜，可在实验室内以最少的设备进行。它只需要少量的蛋白质和tRNA。这比替代生物物理技术有一个优势，通常消耗较大量的样品。
凝胶阻滞测定已广泛用于转录因子的研究。该测定已被用于分析许多不同DNA序列的转录因子的结合动力学，强度和特异性。 EMSA在这个领域确实是第一次开发6,7 。 RNA 8,9,10,11和tRNA分子的凝胶阻滞测定也用于核糖体研究并且像我们这里所说的那样分析在转录后修饰tRNA核苷的酶。
许多不同的参数影响凝胶阻滞测定的结果，例如温度，蛋白质和tRNA样品的质量以及结合强度。仔细规划和执行实验对于释放游离核酸和蛋白质结合物种的结果至关重要。在这里，我们使用编码tRNA（UUU）的合成基因克隆到启动子缺乏Shine-Dalgarno核糖体结合位点的表达载体中，导致大量tRNA2的合成。该详细方案旨在提供执行tRNA凝胶阻滞实验的明确指导，同时避免常见错误。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文描述的蛋白质-TRNA琼脂糖凝胶阻滞测定可以以多种方式进行修饰。首先，可以减少凝胶中琼脂糖的百分比，以使蛋白质tRNA复合物的分离和可视化显着大于本文分析的（120 kDa）。第二，如果目标蛋白是不耐热的，则必须采取额外的预防措施，以确保通过将电泳装置移动到冷藏室或使用电泳室内的冰袋将温度保持在最高可接受温度以下，以立即消散产生的热量在运行期间。如果需要或可接受的样…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCV是CIB校内计划“更好生命的分子机器”（MACBET）的成员。导致这些结果的研究已经获得了西班牙萨洛德卡洛斯III研究所（PI12 / 01667至MCV）的资助，西班牙经济贸易部长（CTQ2015-66206-C2-2-R和SAF2015-72961-EXP至MCV） ），马德里区域政府（S2010 / BD-2316至MCV）和欧盟委员会（框架计划7（FP7））项目ComplexINC（MCV合同号279039）。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定出版或准备稿件方面没有任何作用。
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
Referências
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