심장 근육 세포 기반 액츄에이터 및 자체 안정화 바이오 오봇 - 제 2 부
Summary
이 연구에서는 기능화 된 엘라스토머 캔틸레버 암을 갖춘 생물학적 액추에이터와 자체 안정화 수영 biorobot에 심근 세포를 뿌리고 배양하여 시간에 따른 생화학 및 생체 역학 특성을 분석했습니다.
Abstract
최근에는 합성 기계적 백본과 통합 된 살아있는 세포 또는 조직 구성 요소로 구성된 하이브리드 장치가 개발되었습니다. 비 오로봇 (biorobots)이라고 불리는이 장치는 살아있는 구성 요소의 수축 활동에서 생성 된 힘에 의해서만 구동되며, 많은 고유 한 이점으로 인해 기존의 완전 인공 로봇의 대안이 될 수 있습니다. 여기서는이 두 부분으로 구성된 기사의 첫 번째 부분에서 설계, 제작 및 기능화 된 생물학적 액추에이터와 바이오 오봇을 시드하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 염기 및 박막 캔틸레버로 구성된 조작 된 생물학적 액추에이터 및 바이오 오봇 장치를 피브로넥틴으로 세포 부착을 위해 작용 화시켰다. 기능화 후에, 신생아 쥐의 심근 세포를 고밀도로 PDMS 캔틸레버 팔에 파종하여 합류 세포 시트를 얻었다. 장치는 매일 이미지화되었고 캔티 (canti)의 움직임레버 암이 분석되었다. 파종 후 2 일째에, 우리는 자발적 수축 중에 세포에 의해 가해지는 힘으로 인한 외팔보의 굽힘을 관찰했다. 캔틸레버 벤딩 (cantilever bending)의 정량 분석에서, 세포가 시간에 따라 성숙함에 따라 표면 스트레스가 점진적으로 증가하는 것이 관찰되었다. 마찬가지로, 우리는 지느러미 역할을하는 PDMS 외팔보 암 (cantilever arm)의 작동으로 인해 생체 로봇의 움직임을 관찰했다. 장치의 수영 프로파일을 정량화함에 따라, 핀의 정지 각도에 의해 영향을받는 다양한 추진 모드가 관찰되었다. 운동 방향과 고동 주파수는 지느러미의 정지 각도에 의해서도 결정되었고, 142μm / s의 최대 수영 속도가 관찰되었다. 이 원고에서 우리는 조작 된 장치를 심근 세포로 채우는 과정과 생물학적 액추에이터 및 바이오로봇 활동을 평가하는 절차를 설명합니다.
Introduction
바이오 오봇 (Biorobots)은 일반적으로 PDMS 나 하이드로 겔 (hydrogels)과 같은 부드럽고 신축성있는 물질로 구성된 기계적 백본에 통합 된 살아있는 세포를 기반으로 한 장치입니다. 세포는 자발적으로 또는 자극에 반응하여 리듬 수축을 겪고, 따라서 액츄에이터로서 기능한다. 세포 수축으로부터 생성 된 힘은 다양한 바이오 오봇 (biorobot)을 유도합니다. 포유 동물의 심장 세포 (cardiomyocytes)와 골격 근육 세포는 수축 특성으로 인해 비오 로봇의 작동에 종종 사용됩니다. 심근 세포와 골격근 세포 외에 곤충 근육 조직 2 와 외과 근육 조직 3 과 같은 다른 세포 유형이 사용되었습니다. 곤충 근육 조직은 실온에서 생물학적 액추에이터의 작동을 가능하게합니다.
biorobot의 기능과 성능은 주로 생물학적 액추에이터의 강도와 일관성에 의해 결정됩니다 ( 즉,. 근육 세포), 기계적 백본 구조는 주로 운동, 안정성 및 힘의 메커니즘을 결정합니다. 이러한 장치는 전지에서 발생하는 힘에 의해서만 구동되기 때문에 화학적 오염 물질이나 작동 소음이 없습니다. 따라서 다른 기존 로봇에 비해 에너지 효율적인 대안을 형성합니다. 다양한 문헌에서 살아있는 세포와 조직을 생체 로봇 1 , 4 , 5에 통합하는 다양한 방법에 대해 논의 해 왔습니다. 미세 제작 및 조직 공학 기술의 진보로 도보, 그립, 수영 또는 펌프 작동이 가능한 비 오보봇 (biorobot)을 개발할 수있었습니다. 일반적으로, 세포는 합류 세포 시트로서 기계적 (중합체) 백본 상에 직접 배양되거나, 링 및 스트립과 같은 비계 내의 3 차원 액츄 에이션 구조로 몰딩된다. 대부분의 경우, 비오 로봇은이들 세포는 외부 자극없이 자발적 수축을 나타내는 본래의 능력을 가지기 때문에, 심근 세포 시트 ( 6 , 7 )를 사용하여 제조된다. 한편, 골격 근육 세포 시트에 대한 보고서는 막 탈분극을 시작하기 위해 체외 에서 수축을 시작하는 자극이 필요하기 때문에 제한됩니다 8 .
이 프로토콜은 먼저 얇은 PDMS 외팔보로 만들어진 기능화 된 생물 학적 액츄에이터에 cardiomyocytes를 심는 방법을 설명합니다. 그런 다음 수영 프로필의 파종과 분석에 대해 자세히 설명합니다. 캔틸레버는 피브로넥틴과 같은 세포 접착 성 단백질로 관능 화되고 심근 세포와 합류하여 시딩된다. 세포가 장치 계약서에 뿌리면 캔틸레버가 구부러져 작동기 역할을합니다. 시간이 지남에 따라 세포가 성숙함에 따라 세포의 표면 스트레스 변화를 추적합니다.캔틸레버 벤딩. 여기에서 개발 된 생물학적 액추에이터는 섬유 아세포 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포와 같은 모든 세포 유형의 수축 특성을 분화를 결정할 때 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
biorobot에 대한 이전 연구의 대부분은 생물학적 액추에이터 개발에 초점을 두었지만 biorobot 아키텍처 및 기능 기능의 최적화는 대부분 무시되었습니다. 최근에는 자연에서 영감을 얻은 바이오 오봇 (biorobots)에서 수영 모드를 구현 한 몇 가지 연구가 있습니다. 예를 들어, 편모충을 기반으로 한 운동 6 , 해파리 추진 9 , 바이오 하이브리드 광선 4 를 이용한 수영 biorobots가 설계되었습니다. 다른 문학 작품 들과는 달리, 여기서 우리는 자기 안정화 구조를 만들기 위해 기계적 백본의 성질을 변화 시키는데 중점을 둔다. 이 연구에서 개발 된 바이오 오봇 (biiorobot)은 일정한 피치, 롤, 그리고 메신저를 유지할 수있다.그것이 수영 할 때의 수심. 이 매개 변수는 각 기본 합성물의 두께를 변경하여 수정할 수 있습니다. PDMS 액추에이터, submergible biorobot 및 장치의 기능화 개발과 관련된 제작 단계는이 두 편의 기사의 Part 1과 최근 작업 7 에서 자세히 설명합니다. 여기에서 개발 된 기술은 화물 운송과 같은 다양한 어플리케이션을위한 고효율의 비 오로봇 (biorobot)을 개발할 수 있습니다.
이 연구에서 수행 된 격리 과정은 초기 연구 10 과 최근 출판 된 연구 7 에서 설명한 과정과 유사합니다. PDMS 액추에이터 및 바이오 오로봇 장치를 제작하는 데 사용되는 미세 제작 방법은이 두 편의 원고 파트 1에 자세히 설명되어 있습니다. 이 원고의 프로토콜 섹션은 조작 된 PDMS에 심근 세포를 파종하는 단계를 설명합니다.ctuator 및 biorobot을 세포 접착 단백질로 기능화시킨 후
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 절차는 PDMS 기반 액추에이터 및 biorobots에 대한 성공적인 시딩 방법을 설명하며, 이는 심근 세포의 부착을 용이하게합니다. 또한, 세포의 행동과 장치의 성능을 특징 짓는 이미지 수집 및 후속 분석 프로세스가 설명되었습니다.
우리는 24 시간 후 cantilever arms에서 세포의 자발적 수축을 관찰했다. 수축의 강도는 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가하여 6 일째에 최?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MT Holley는 Louisiana Board of Regents의 Graduate Fellows 프로그램에서 지원하고 C. Danielson은 Howard Hughes Medical Institute 교수 프로그램의 지원을받습니다. 이 연구는 NSF 보조금 번호 : 1530884에 의해 지원됩니다.
Materials
| Chemicals and reagents | |||
| Cardiomyocytes (primary cardiac cells) | Charles River | NA | Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats |
| Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate |
| Fetalclone III serum | Hyclone industries, GE | 16777-240 | Fetal bovin serum (FBS) |
| Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | Solution (1 mg/ml) |
| Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) | Molecular Probes | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Molecular Probes | F14217 | calcium indicator dye |
| Tyrodes salt solution | Sigma-Aldrich | T2397 | buffer solution |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P3000MP | nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO) |
| 16% Parafomaldehyde | Electron microscopy | 15710 | Caution: Irritant and combustible |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X-100 100 mL | cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) |
| ProLong gold antifade reagent | Molecular Probes | P10144 | Mounting agent |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes | A12381 | Actin filament marker |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | A-11012 | |
| pha | Molecular Probes | A-11001 | |
| Anti-connexin 43 antibody | Abcam | ab11370 | Gap junction marker |
| Anti-cardiac troponin I antibody | Abcam | ab10231 | Contractile protein |
| 16% EM grade paraformaldehyde solution | Electron microscopy | 100503-916 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Elsevier | Sylgard 184 | |
| Materials and Equipment | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| LED light strip | NA | NA | Any white LED without spectrum emission |
| Confocal microscope | Nikkon C2 | NA | Confocal microscope with three filter set. |
| Zooming lens | Infinity | Model# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | Used in Section 4) for biological actuator analysis. |
| Image J | National Institute of Health | NA | Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | Camera operating software |
Referências
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