שריר הלב מבוססי תא מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 2
Summary
במחקר זה, actuator ביולוגי עצמית התייצבות, biorobot שחייה עם זרועות פונקציונליות אלסטומרי פונקציונלי מזרקים עם cardiomyocytes, מתורבת, ומאופיינת המאפיינים הביוכימיים והביומכניים שלהם לאורך זמן.
Abstract
בשנים האחרונות, התקנים היברידיים המורכבת של תא חי או רכיב רקמה משולב עם חוט שדרה סינתטי פותחו. התקנים אלה, הנקראים biorobots, מופעלים אך ורק על ידי כוח שנוצר על ידי פעילות מכווצת של הרכיב החי, בשל היתרונות הטבועים רבים, יכול להיות חלופה קונבנציונאלי מלא רובוטים מלאכותיים. כאן, אנו מתארים את שיטות זרע לאפיין actuator ביולוגי biorobot שתוכנן, מפוברק, ו functionalized בחלק הראשון של מאמר זה שני חלקים. מפעיל ביולוגי מפוברק ומכשירי biorobot המורכבים מבסיס polydimethylsiloxane (PDMS) וממשק סרט דק היו פונקציונליים עבור התקשרות תא עם fibronectin. לאחר functionalization, cardiomyocytes חולדה neonatal היו seeded על הזרוע PDMS זרוע בצפיפות גבוהה, וכתוצאה מכך גיליון תאים confluent. המצלמות היו צילמו כל יום ותנועת הקאנטיזרועות המנוף נותחו. ביום השני לאחר הזריעה, ראינו את כיפוף הזרועות שלוחות בשל כוחות המופעל על ידי התאים במהלך התכווצויות ספונטנית. לאחר ניתוח כמותי של כיפוף שלוחה, עלייה הדרגתית הלחץ פני השטח המופעל על ידי התאים כפי שהם התבגרו לאורך זמן נצפתה. כמו כן, ראינו התנועה של biorobot עקב actuation של הזרוע PDMS זז, אשר פעל כסנפיר. עם כימות של פרופילי השחייה של המכשירים, נצפו מצבים הנעה שונים, אשר הושפעו בזווית המנוחה של הסנפיר. כיוון התנועה ותדר המכות נקבעו גם על ידי זווית המנוחה של הסנפיר, ורמת מהירות מקסימלית של 142 מיקרומטר לשנייה נצפתה. בכתב יד זה, אנו מתארים את הנוהל לאכלוס המכשירים המפוברקים עם קרדיומיוציטים, וכן להערכת המפעיל הביולוגי ופעילות ביורובוט.
Introduction
Biorobots הם מכשירים המבוססים על תאים חיים כי הם משולבים בתוך עמוד שדרה מכני כי הוא מורכב בדרך כלל מחומרים רכים, גמישים, כגון PDMS או הידרוג 1 . התאים עוברים צירים קצביים, או באופן ספונטני או בתגובה לגירויים, ובכך מתפקדים כמפעיל. הכוח שנוצר מכווץ התא כונני biorobots שונים. תאים לב יונקים (cardiomyocytes) ותאי שריר השלד משמשים לעתים קרובות עבור actuation biorobot בשל המאפיינים התכווצות שלהם. מלבד cardiomyocyte ותאי שריר השלד, סוגים אחרים של תאים, כגון רקמות שריר חרקים 2 ו tissanted רקמות שריר 3 , כבר בשימוש. רקמות שריר חרקים לאפשר את הפעולה של המפעילים הביולוגיים בטמפרטורת החדר.
הפונקציה והביצוע של biorobot נקבעים בעיקר על ידי כוח ועקביות של מפעיל ביולוגי ( כלומר. תאי שריר), בעוד מבנה עמוד השדרה מכני קובע בעיקר את מנגנוני התנועה, היציבות, ואת הכוח. מכיוון שמכשירים אלה מונעים אך ורק על ידי כוחות הנוצרים על ידי תאים, אין מזהמים כימיים או רעשים תפעוליים. לכן, הם מהווים חלופה חסכונית באנרגיה לרובוטים קונבנציונליים אחרים. מקורות ספרות שונים דנו בשיטות השונות לשלב תאים חיים ורקמות לתוך biorobots 1 , 4 , 5 . ההתקדמות microfabrication ורקמות טכניקות הנדסה אפשרו את הפיתוח של biorobots שיכול ללכת, אחיזה, לשחות, או משאבת 5 , 6 . באופן כללי, תאים מתורבתים ישירות על עמוד השדרה מכני (פולימרי) כמו גיליון תא confluent או שהם יצוק לתוך מבנים actuating 3 ממדי בתוך פיגומים כגון טבעות ופסים. לרוב, biorobots הםמפוברק באמצעות גליונות cardiomyocyte 6 , 7 , כמו תאים אלה יש יכולת מולדת להפגין התכווצות ספונטנית ללא גירויים חיצוניים. מצד שני, דיווחים על גיליונות שלד שרירי השלד מוגבלים בשל הצורך שלהם לגירויים כדי ליזום התכווצויות במבחנה על מנת ליזום deolarization ממברנה 8 .
פרוטוקול זה הראשון מתאר כיצד cardiomyocytes זרע על actuator ביולוגי פונקציונלי עשוי שלוחה PDMS דק. לאחר מכן הוא מתאר בפירוט את זריעת וניתוח של פרופילי השחייה. שלוחה הוא functionalized עם חלבון דבק תא כגון fibronectin והוא seeded confluently עם cardiomyocytes. כמו התאים seeded על חוזה המכשיר, הם גורמים שלוחה להתכופף ובכך לפעול כמפעיל. עם הזמן, כמו התאים בוגרת, אנו עוקבים אחר השינויים בלחץ פני השטח על המכשיר על ידי ניתוח קטעי וידאו שלכיפוף שלוחה. המפעיל הביולוגי שפותח כאן ניתן להשתמש כדי לקבוע את המאפיינים של כל סוג התא, כגון fibroblasts או המושרה pluripotent גבעולים תאים, כפי שהם עוברים differiation.
רוב המחקרים המוקדמים על ביורובוטס התמקדו בפיתוח של מיזמים ביולוגיים, בעוד שהמיטוב של ארכיטקטורת הביורובוט והיכולות הפונקציונליות הוזנח במידה רבה. לאחרונה, כמה מחקרים הוכיחו את יישום מצבי שחייה ב biorobots כי הם בהשראת הטבע. לדוגמה, שחייה biorobots עם תנועה מבוססת flagella 6 , הנעה מדוזה 9 , וקרני ביו היברידית 4 כבר מהונדסים. שלא כמו עבודות אחרות בספרות, כאן אנו מתמקדים משתנה המאפיינים של עמוד השדרה מכני ליצור מבנה מייצב את עצמי. Biorobot שפותחו במחקר זה מסוגל לשמור על גובה קבוע, רול, ו- IMעומק המרעה כפי שהוא שוחה. פרמטרים אלה ניתן לשנות על ידי שינוי עובי של כל מרוכב בסיס. את השלבים ייצור מעורב בפיתוח PDMS actuator, biorobot הצוללת, ופונקציונליזציה של המכשיר מתוארים בפירוט בחלק 1 של מאמר זה שני חלקים, כמו גם בעבודה האחרונה שלנו 7. הטכניקה שפותחה כאן יכול לסלול את הדרך לפיתוח של biorobots חדש, יעיל מאוד עבור יישומים שונים, כגון משלוח המשלוח.
תהליך הבידוד במחקר זה דומה לתהליך המתואר בעבודה קודמת 10 , וכן בעבודות שפורסמו לאחרונה. שיטות microfabrication המשמשים להבראת PDMS actuators והתקנים biorobot מתוארים בפירוט בחלק 1 של כתב היד הזה שני חלקים. סעיף הפרוטוקול של כתב היד הזה מתאר את השלבים הכרוכים זריעת cardiomyocytes על PDMS מפוברק אCtuator ואת biorobot בעקבות functionalization שלהם עם חלבונים דבק התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך המתואר כאן מתאר שיטת זריעה מוצלחת עבור PDMS מבוססי actuators ו biorobots, אשר מאפשר את ההתקשרות של cardiomyocytes. יתר על כן, התהליך של רכישת התמונה ואת הניתוח הבאים המאפיינת את ההתנהגות של התאים ואת הביצועים של המכשירים תוארה.
ראינו התכווצות…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MT Holley נתמך על ידי תוכנית עמיתי בוגרים של מועצת לואיזיאנה של ריג 'נט, ו C. דניאלסון נתמך על ידי הווארד יוז המכון הרפואי פרופסורים התוכנית. מחקר זה נתמך על ידי NSF גרנט מס ': 1530884.
Materials
| Chemicals and reagents | |||
| Cardiomyocytes (primary cardiac cells) | Charles River | NA | Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats |
| Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate |
| Fetalclone III serum | Hyclone industries, GE | 16777-240 | Fetal bovin serum (FBS) |
| Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | Solution (1 mg/ml) |
| Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) | Molecular Probes | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Molecular Probes | F14217 | calcium indicator dye |
| Tyrodes salt solution | Sigma-Aldrich | T2397 | buffer solution |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P3000MP | nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO) |
| 16% Parafomaldehyde | Electron microscopy | 15710 | Caution: Irritant and combustible |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X-100 100 mL | cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) |
| ProLong gold antifade reagent | Molecular Probes | P10144 | Mounting agent |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes | A12381 | Actin filament marker |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | A-11012 | |
| pha | Molecular Probes | A-11001 | |
| Anti-connexin 43 antibody | Abcam | ab11370 | Gap junction marker |
| Anti-cardiac troponin I antibody | Abcam | ab10231 | Contractile protein |
| 16% EM grade paraformaldehyde solution | Electron microscopy | 100503-916 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Elsevier | Sylgard 184 | |
| Materials and Equipment | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| LED light strip | NA | NA | Any white LED without spectrum emission |
| Confocal microscope | Nikkon C2 | NA | Confocal microscope with three filter set. |
| Zooming lens | Infinity | Model# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | Used in Section 4) for biological actuator analysis. |
| Image J | National Institute of Health | NA | Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | Camera operating software |
Referências
- Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
- Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274 (2012).
- Herr, H., Dennis, R. G. A swimming robot actuated by living muscle tissue. J. NeuroEng Rehabil. 1, 6 (2004).
- Park, S., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 10125-10130 (2014).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab. Chip. 16, 3473-3484 (2016).
- Hopkins, P. M. Skeletal muscle physiology. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 6, 1-6 (2006).
- Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. JoVE. (79), e50154 (2013).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circ. Res. 87, 275-281 (2000).
- Shin, S. R., et al. Carbon-Nanotube-Embedded Hydrogel Sheets for Engineering Cardiac Constructs and Biological actuators. ACS Nano. 7, 2369-2380 (2013).
- Park, J., et al. Real-Time Measurement of the Contractile Forces of Self-Organized Cardiomyocytes on Hybrid Biopolymer Microcantilevers. Anal. Chem. 77, 6571-6580 (2005).
- Tamayo, J., et al. Quantification of the surface stress in microcantilever biosensors: revisiting Stoney’s equation. Nanotechnology. 23, 475702 (2012).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Methods. 10, 781-787 (2013).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in Cardiomyocyte Isolation, Culture, and Gene Transfer. J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 288-298 (2011).
- Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
- Sfakiotakis, M., Lane, D. M., Davies, J. B. C. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).
