Actionneur à base de cellules musculaires cardiaques et Biorobot auto-stabilisant - Partie 2

Summary

Dans cette étude, un actionneur biologique et un biorobot de stabilisation auto-stabilisable avec des bras en porte-à-faux élastomères fonctionnalisés sont ensemencés avec des cardiomyocytes, cultivés et caractérisés pour leurs propriétés biochimiques et biomécaniques au fil du temps.

Abstract

Au cours des dernières années, des dispositifs hybrides constitués d'une cellule vivante ou d'un composant tissulaire intégré à un squelette mécanique synthétique ont été développés. Ces appareils, appelés biorobots, sont alimentés uniquement par la force générée par l'activité contractile du composant vivant et, en raison de leurs nombreux avantages inhérents, pourrait être une alternative aux robots conventionnels entièrement artificiels. Ici, nous décrivons les méthodes de semence et de caractérisation d'un actionneur biologique et d'un biorobot qui a été conçu, fabriqué et fonctionnalisé dans la première partie de cet article en deux parties. L'actionneur biologique fabriqué et les dispositifs de biorobot composés d'une base de polydiméthylsiloxane (PDMS) et d'un cantilever à film mince ont été fonctionnalisés pour la fixation de cellules avec la fibronectine. Après la fonctionnalisation, les cardiomyocytes néonatals de rat ont été ensemencés sur le bras en porte-à-faux PDMS à haute densité, ce qui a donné lieu à une feuille cellulaire confluente. Les appareils ont été imagés tous les jours et le mouvement du cantiLes bras de levier ont été analysés. Le deuxième jour après l'ensemencement, nous avons observé la flexion des bras en porte-à-faux en raison des forces exercées par les cellules pendant les contractions spontanées. Lors de l'analyse quantitative de la flexion en porte-à-faux, une augmentation graduelle du stress superficiel exercée par les cellules au fur et à mesure de leur maturation au cours du temps a été observée. De même, nous avons observé le mouvement du biorobot en raison de l'actionnement du bras en porte-à-faux PDMS, qui a agi comme une aileron. Lors de la quantification des profils de natation des dispositifs, on a observé différents modes de propulsion qui ont été influencés par l'angle de repos de la nageoire. La direction du mouvement et la fréquence de battement ont également été déterminées par l'angle de repos de l'aileron et une vitesse de nage maximale de 142 μm / s a ​​été observée. Dans ce manuscrit, nous décrivons la procédure pour peupler les dispositifs fabriqués avec des cardiomyocytes, ainsi que pour l'évaluation de l'actionneur biologique et de l'activité de biorobot.

Introduction

Les Biorobots sont des dispositifs basés sur des cellules vivantes qui sont incorporées dans un squelette mécanique qui est habituellement composé de matériaux doux et élastiques tels que PDMS ou hydrogels ¹ . Les cellules subissent des contractions rythmiques, soit spontanément, soit en réponse à des stimuli, et fonctionnent ainsi comme actionneur. La puissance générée par la contraction des cellules entraîne différents biorobots. Les cellules cardiaques de mammifères (cardiomyocytes) et les cellules musculaires squelettiques sont souvent utilisées pour l'actionnement de biorobot en raison de leurs propriétés contractiles. Outre les cellules des cardiomyocytes et des muscles squelettiques, d'autres types de cellules, comme les tissus musculaires ² et les tissus musculaires explantés ³ , ont été utilisés. Les tissus musculaires des insectes permettent le fonctionnement des actionneurs biologiques à température ambiante.

La fonction et la performance d'un biorobot sont principalement déterminées par la force et la cohérence de l'actionneur biologique ( c.-à-d.. Cellules musculaires), tandis que la structure du squelette mécanique détermine principalement les mécanismes de la locomotion, de la stabilité et de la puissance. Étant donné que ces dispositifs sont uniquement alimentés par des forces générées par les cellules, il n'y a pas de polluants chimiques ou de bruits d'exploitation. Par conséquent, ils forment une alternative économe en énergie à d'autres robots classiques. Plusieurs sources de littérature ont discuté des différentes méthodes pour intégrer les cellules vivantes et les tissus dans les biorobots ^{1 , 4 , 5} . Des progrès dans les techniques de microfabrication et de génie tissulaire ont permis le développement de biorobots qui peuvent marcher, s'accrocher, nager ou pomper ^{5 , 6} . En général, les cellules sont cultivées directement sur le squelette mécanique (polymère) en tant que feuille de cellule confluente ou elles sont moulées dans des structures d'actionnement tridimensionnelles dans des échafaudages tels que des anneaux et des bandes. Le plus souvent, les biorobots sontFabriqués à l'aide de feuilles de cardiomyocytes ^{6 , 7} , car ces cellules ont une capacité innée à présenter une contraction spontanée sans stimuli externe. D'autre part, les rapports sur les feuilles de cellules musculaires squelettiques sont limités en raison de leur besoin de stimuli pour initier des contractions in vitro afin d'initier une dépolarisation de la membrane ⁸ .

Ce protocole décrit d'abord comment semer des cardiomyocytes sur un actionneur biologique fonctionnalisé constitué d'un mince PDMS en porte-à-faux. Il décrit ensuite en détail l'ensemencement et l'analyse des profils de natation. Le cantilever est fonctionnalisé avec une protéine adhésive cellulaire telle que la fibronectine et est ensemencé confluent avec les cardiomyocytes. En tant que cellules ensemencées sur le contrat de l'appareil, elles font que le porte-à-faux se plie et agit comme actionneur. Au fil du temps, à mesure que les cellules arrivent à maturité, nous analysons les changements de stress superficiel sur l'appareil en analysant des vidéos de laFlexion en porte-à-faux. L'actionneur biologique développé ici peut être utilisé pour déterminer les propriétés contractiles de n'importe quel type de cellule, comme les fibroblastes ou les cellules de tiges pluripotentes induites, puisqu'elles subissent une différenciation.

Une grande partie de la recherche antérieure sur les biorobots a été axée sur le développement d'actionneurs biologiques, tandis que l'optimisation de l'architecture et des capacités fonctionnelles de Biorobot a été largement négligée. Récemment, quelques études ont démontré la mise en place de modes de natation dans les biorobots qui s'inspirent de la nature. Par exemple, les biorobots de natation avec le mouvement à base de flagelles ⁶ , la propulsion des méduses ⁹ et les rayons bio-hybrides ⁴ ont été conçus. Contrairement à d'autres travaux dans la littérature, nous nous concentrons ici sur la variation des propriétés du squelette mécanique pour créer une structure auto-stabilisante. Le biorobot développé dans cette étude est capable de maintenir un ton, un roulement constant et unProfondeur de morsion pendant qu'il nage. Ces paramètres peuvent être modifiés en faisant varier l'épaisseur de chaque composite de base. Les étapes de fabrication impliquées dans le développement de l'actionneur PDMS, du biorobot immergé et de la fonctionnalisation du dispositif sont décrites en détail dans la partie 1 de cet article en deux parties, ainsi que dans notre travail récent ^7. La technique développée ici peut ouvrir la Mode de développement de biorobots nouveaux et hautement efficaces pour diverses applications, telles que la livraison de fret.

Le processus d'isolement suivi dans cette étude est similaire au processus décrit dans un travail antérieur ¹⁰ , ainsi que dans les travaux récemment publiés ⁷ . Les méthodes de microfabrication utilisées pour fabriquer les actionneurs PDMS et les dispositifs biorobot sont décrites en détail dans la partie 1 de ce manuscrit en deux parties. La section de protocole de ce manuscrit décrit les étapes de l'implantation de cardiomyocytes sur le PDMS fabriqué aCtuator et le biorobot après leur fonctionnalisation avec des protéines adhésives cellulaires.

Protocol

Toutes les procédures décrites ici ont été menées à l'aide d'un protocole approuvé et conformément aux règlements du Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux de l'Université de Notre Dame. 1. Semence cellulaire et culture Avant de commencer, préparez les éléments requis: un petit entonnoir, des pipettes et un milieu Eagle Eagle modifié par Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% d'antibiotique péni…

Representative Results

L'actionneur biologique constitué d'un mince PDMS en porte-à-faux (25 μm d'épaisseur) et de cardiomyocytes constitue le noyau de la natation biorobot, comme le montrent les schéma et la capture d'écran des dispositifs de la figure 1 . Les cellules commencent à présenter des contractions après 24 h en culture et la flexion des bras en porte-à-faux a été observée au jour 2. Le profil latéral de l'appareil a été enregistré tous les jours…

Discussion

La procédure décrite ici décrit une méthode d'ensemencement réussie pour les actionneurs et les biorobots à base de PDMS, ce qui facilite la fixation de cardiomyocytes. En outre, le processus d'acquisition d'image et l'analyse ultérieure qui caractérise le comportement des cellules et la performance des appareils ont été décrits.

Nous avons observé une contraction spontanée des cellules sur les bras en porte-à-faux après 24 h; L'intensité des contractions …

Materials

Chemicals and reagents
Cardiomyocytes (primary cardiac cells)	Charles River	NA	Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats
Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate
Fetalclone III serum	Hyclone industries, GE	16777-240	Fetal bovin serum (FBS)
Dulbecco’s phosphate buffer (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Penicillin-G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141	Solution (1 mg/ml)
Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay)	Molecular Probes	L3224
Calcium Fluo-4, AM	Molecular Probes	F14217	calcium indicator dye
Tyrodes salt solution	Sigma-Aldrich	T2397	buffer solution
Pluronic F-127	Molecular Probes	P3000MP	nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)
16% Parafomaldehyde	Electron microscopy	15710	Caution: Irritant and combustible
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X-100 100 mL	cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)
ProLong gold antifade reagent	Molecular Probes	P10144	Mounting agent
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Molecular Probes	A12381	Actin filament marker
Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probes	A-11012
pha	Molecular Probes	A-11001
Anti-connexin 43 antibody	Abcam	ab11370	Gap junction marker
Anti-cardiac troponin I antibody	Abcam	ab10231	Contractile protein
16% EM grade paraformaldehyde solution	Electron microscopy	100503-916
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Elsevier		Sylgard 184
Materials and Equipment
Camera	Thor Labs	DCC1545M
LED light strip	NA	NA	Any white LED without spectrum emission
Confocal microscope	Nikkon C2	NA	Confocal microscope with three filter set.
Zooming lens	Infinity	Model# 252120
Software
Matlab	Mathworks	NA	Used in Section 4) for biological actuator analysis.
Image J	National Institute of Health	NA	Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor Cam	Thor Labs	NA	Camera operating software