Et grafisk brugergrænseflade til softwareassisteret sporing af proteinkoncentration i dynamiske cellulære protrusioner

Summary

Vi præsenterer en software løsning til semi-automatiseret sporing af relativ protein koncentration langs længden af ​​dynamiske cellulære fremspring.

Abstract

Filopodier er dynamiske, fingerlignende cellulære fremspring forbundet med migration og cellecellekommunikation. For bedre at forstå de komplekse signalmekanismer, der ligger til grund for filopodial initiering, forlængelse og efterfølgende stabilisering eller tilbagetrækning, er det afgørende at bestemme den spatio-temporale proteinaktivitet i disse dynamiske strukturer. For at analysere proteinfunktion i filopodi udviklede vi for nylig en halvautomatiseret sporingsalgoritme, der tilpasser sig filopodiale formændringer, hvilket muliggør parallelanalyse af fremspringsdynamik og relativ proteinkoncentration langs hele filopodiallængden. Her præsenterer vi en detaljeret trin-for-trin protokol for optimeret cellehåndtering, billedoptagelse og softwareanalyse. Vi giver yderligere anvisninger om brugen af ​​valgfrie funktioner under billedanalyse og datarrepræsentation samt retningslinjer for fejlfinding for alle kritiske trin undervejs. Endelig indeholder vi også en sammenligning af dSkræddersyet billedanalysesoftware med andre programmer til filopodi-kvantificering. Sammen giver den præsenterede protokol en ramme for nøjagtig analyse af proteindynamik i filopodiale fremspring ved hjælp af billedanalysesoftware.

Introduction

Spatio-temporal kontrol af actin regulatoriske proteiner er forbundet med filopodiumdynamik ^{1 , 2} . Sporing af rumligt løst proteinkoncentration langs hele filopodiallængden gennem tiden er således afgørende for at fremme vores forståelse af mekanismerne underliggende initiation, forlængelse, stabilisering eller sammenbrud af disse dynamiske strukturer ^{3 , 4} . I modsætning til proteinanalyse i cytosol, hvor mange celleformændringer forekommer i større målestok, er filopodier dynamiske mikrostrukturer, der konstant spænder ⁵ og bøjer og dermed udelukker analyse ved hjælp af en simpel tilgang, såsom en linjeskanning.

Forskellige software løsninger til sporing af filopodial form er tilgængelige ^{6 , 7 , 8 , 9} . LikewIse, software til ratiometrisk sporing af proteindynamik i cellekroppen er blevet udviklet ^{10 , 11} . For at kombinere automatiseret sporing af filopodial form og spatio-temporal proteinanalyse har vi for nylig udviklet en billedanalysesoftware baseret på den konvekse skrogalgoritme ¹² . Denne nye analysemetode, der drives via en grafisk brugergrænseflade (GUI), kombinerer for første gang den relative proteinkoncentration langs filopodiallængden og væksthastigheden, hvilket tillader den nøjagtige måling af spatio-temporal proteinfordeling uafhængig af bevægelsen af ​​disse Dynamiske strukturer ¹² .

Ideen bag softwaren (kildekoden er frit tilgængelig, se nedenfor) er, at en af ​​det konvekse skrogs hjørner vil falde sammen med toppen af ​​filopodiet ( figur 1A ). Ved at se i den efterfølgende ramme foR det nærmeste hjørne af det konvekse skrog, kan den bevægelige spids spores gennem hele filmen. Når spidsen er detekteret i hver ramme, bruges dens position til at tegne en akse ved at forbinde spidsen med et referencepunkt ved bunden af ​​filopodiet ( figur 1B ). Endelig anvendes der ved anvendelse af ækvivalente knudepunkter, hvis positioner bestemmes af median pixel med maksimal intensitet langs linien ortogonale til aksen, til at bestemme en rygrad, som følger filopodial form. Udnyttelse af denne adaptive rygrad genereres en kymografi for at spore filopodial vækst og proteinkoncentrationer for op til tre kanaler langs filopodiallængden ( figur 1C ).

Figur 1: Arbejdsprincip for billedanalysesoftwaren. ( A ) Algoritmen bagvedSoftwaren. I trin 1 specificerer brugeren referencen (basen) og toppunktet (spidsen) af filopodiet. I trin 2-1 opnås filopodiumets rygrad ved hjælp af median pixel med maksimal intensitetsværdi. I trin 3 anvendes rygraden til rumlig proteinintensitetsprofil. I trin 2-2 sporer softwaren automatisk spidsen i den efterfølgende ramme. Hele proceduren gentager. ( B ) Snapshot af algoritmen med ægte filopodium, der introducerer vigtige elementer som det konvekse skrog, der bruges til sporing. ( C ) Oversigt over parametre, som kan måles med algoritmen. Dette tal er blevet ændret fra reference ¹² . Klik her for at se en større version af denne figur.

Billedanalyseprogrammet betjenes i Matlab (benævnt programmeringssoftware) via en grafisk brugR interface. For at maksimere fleksibilitet og robusthed til den pågældende eksperimentelle indstilling kan brugeren justere en række sporingsparametre ( f.eks. Tilladt bøjningsvinkel og mellemrammebevægelse) og også foretage nogle korrektioner i filmene ( f.eks. Beskæring, rotation, fjernelse af uønskede objekter) ( Figur 2A og tabel 1) .

<td colspan="5"> Ilægning af stablet billedfil svarende til protein 1 <td> 6h <td> 9d

GUI	Ingen.	Obligatorisk	Beskrivelse					Navn (i GUI)
# 1	1a	Y	Indlæsning af stablet .tiff-fil, der repræsenterer cellelegemet (med boks tjekket ind) eller oprettet overlejret cellelegeme fra kanaler					CellBody
# 1	1b	Y	Protein 1
# 1	1c	Y	Indlæser stablet billedfil svarende til protein 2					Protein 2
# 1	1d	Y	Ilægning af stablet billedfil svarende til protein 3					Protein 3
# 1	1e	N	Nulstiller alt til forudindlæste stablede billedfiler					Nulstille
# 1	2a	Y	Rulestang for at bestemme den indledende ramme til analyse i GUI-vindue nr. 2					NA
# 1	2b	Y	Rulestang for at bestemme den endelige ramme til analyse i GUI vindue nr. 2					NA
# 1	2c	Y	Rullefelt repræsenterer curreNt ramme					NA
# 1	2d	N	Den grå værdi af pixlerne nedenfor, hvor alle pixels vil blive indstillet til nul					NA
# 1	2e	N	Den grå værdi af pixlerne over hvilke alle pixels vil blive indstillet til maksimale værdier					NA
# 1	2f	N	Indstil intensitetsværdierne for de pixels, der er angivet af <2e> & <2f>					Sæt
# 1	2g	N	Afspil den intensitetsjusterede film					Spille
# 1	2h	N	Beskær billede					Afgrøde
# 1	2i	N	Rotér billede					Rotere
# 1	2j	N	Slet regioner i hele stakken					Slet regioner
# 1	3a	Y	Klik for at åbne 'Analysevindue' (GUI vindue nr. 2)					Tracking Window
# 1	3b	Y	Indtast størrelsen på en pixel i mikroner					Indtast pixelstørrelse
# 2	4	Y	Klik for at generere grænsen / kantbilledet af den overlejrede cellekrop					Grænse
# 2	5	Y	Klik for at vælge base og tip af filopodien					Referernce
# 2	6a	Y	Indtast antallet af segmenter eller noder					Ingen af ​​segmenter
# 2	6b	Y	Indtast scanningslængden (vinkelret på akse)					Scanbredde
# 2	6c	Y	Indtast længden over hvilken filopodia begynder at bøje					Nøjagtige mål efter
# 2	6d	Y	Indtast radius af tipdetektionscirklen (dvs. område, hvor vertexet kan lokaliseres i den næste ramme)					Radius af spidsopdagelse
# 2	6e	Y	Indtast den maksimale vinkel, som filopodiet kan bøjes fra den vertikale akse					Vinkelgrænse
# 2	6f	N	Tilføj referencepunkter for base og tip til den specifikke ramme					Vælg reference
# 2	6g	N	Indtast længden over hvilken filopodia begynder at bøje for den pågældende ramme					Nøjagtige mål efter
# 2	N	Indtast radius for detektionscirkel for den pågældende ramme					Radius af spidsopdagelse
# 2	6i	N	Efter indtastning af alle parametrene for den specifikke ramme klik for at gemme værdierne til hukommelse og fil for yderligere reference					Tilføje
# 2	6j	N	Klik for at slette de indstillede manuelt parametre for den pågældende ramme					Slet
# 2	6k	N	Klik for at slette alle parametre, der er gemt manuelt, ved hjælp af panelet "valgfrit funktioner" for alle rammer					Nulstille
# 2	6l	N	Check ind før sporing for at gemme alle sporingsresultater i hukommelsen for fremtidig reference					Historie spor
# 2	7	Y	Klik for at starte sporing					Spor & Analyse
# 2	8a	N	Klik for at begynde at spore proteinkanalintensitet					Analyser proteinintensiteter
# 2	8b	N	Check ind for at spore proteinkanalintensitet langs filopodiallængden					Hele filopodier
# 2	8c	N	Check ind for at spore referenceproteinet eller proteinet A					protein A
# 2	8d	N	Check ind for at spore protein B					ProteinB
# 2	8e	N	Check ind for at spore proteinet C					ProteinC
# 2	8f	N	Check ind for at spore gennemsnitlig proteinintensitet i thE tip					Ledende tip
# 2	8g	N	Indtast spidsens længde					Tip længde
# 2	8h	N	Indtast den minimale afstand fra bunden, over hvilken spidsen begynder at danne					Grænseværdi
# 2	8i	N	Klik for at gemme ledende tipanalyseresultater til filen					Trykknap
# 2	9a	N	Klik for at indlede ratiometrisk proteinanalyse					Sammenligne
# 2	9b	N	Check ind for at sammenligne protein B med hensyn til A					log10 (B / A)
# 2	9c	N	Check ind for at sammenligne protein C med hensyn til A					log10 (C / A)
# 2	N	Check ind for at sammenligne protein B med hensyn til A på spidsen					log10 (B / A)
# 2	9e	N	Check ind for at sammenligne protein C med hensyn til A på spidsen					log10 (C / A)
# 2	10a	N	Vælg andet farvekort (standard: Jetplot)					Farvekort
# 2	10b	N	Rediger colormap					Rediger colormap

Tabel 1: Oversigt over alle funktioner, der findes i GUI Windows # 1 og # 2.

Når dette er opnået, skaber programmet et konvekst skrog og sporer automatisk spidsen i hele filmen. Parametre uddraget fra filmen, såsom en ratiometrisk kymografi, væksthastighed og filopodial længde aVises igen og gemmes også i arbejdsmappen som billeder og som datafiler. Andre parametre såsom filopodial levetid, væksthastighed og tilbagetrækningsgrad kan derefter ekstraheres og analyseres yderligere fra de lagrede datafiler ( figur 2B ).

Figur 2: Grafisk brugergrænseflade til brug af Image Analysis Software. ( A ) GUI Window # 1 bruges til at indlæse og behandle billeder. Programmet kan indlæse op til 3 proteinkanaler, hvorved 2 kanaler sammenlignes parvis. Vinduet leveres med obligatorisk (blå) og valgfri egenskaber (grøn) til forbehandling af billederne forud for sporing ( B ) GUI Window # 2 bruges til at spore filopodium samt spatio-temporal og ratio-metrisk proteinanalyse. Igen er valgfrie funktioner markeret i grønt. Dette tal er blevet ændretUdgår fra reference ¹² . Klik her for at se en større version af denne figur.

Her præsenterer vi en detaljeret protokol til prøveudarbejdelse og softwarehåndtering. Vi starter med detaljerede instruktioner om dyrkning af celler og erhvervelse af film optimeret til billedanalyse. Dette afsnit om dataindsamling efterfølges af en detaljeret beskrivelse for drift af billedanalysesoftwaren. Gennem protokollen introducerer vi kritiske trin og valgfrie funktioner, der bør overvejes, når data indsamles og behandles. Endelig analyserer vi filopodier fra forskellige modelsystemer med billedanalyseprogrammet inden lukning med en sammenligning af den beskrevne billedanalysesoftware med andre programmer til filopodial kvantificering og en diskussion om begrænsninger og fremtidig retning.

Protocol

1. Cell Culture Culture HeLa eller COS celler i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende 4,5 g / L D-glucose, L-alanin-L-glutamindipeptid, Pyruvat, 10% føtalt bovint serum og 10 enheder / ml penicillin / streptomycin. Kulturneuroner i kulturmedier uden L-glutamin, glutaminsyre eller asparaginsyre, suppleret med 0,5 mM L-alanin-L-glutamindipeptid, serumfrie neuronale kosttilskud og 10 enheder / ml penicillin / streptomycin. Når først 40% konfluens er nået, transficere celler med v…

Representative Results

Ved hjælp af COS-celler transficeret med en markør for filamentøs actin (f-tractin 18 , rød) og en cytosolisk reference (grøn), fandt vi actinrige filopodiale fremspring ( figur 3A , toppanel). Tidsserier viste, at filopodier hurtigt strækker sig og trækker sig tilbage ( Figur 3A , midtpanel). Ved hjælp af billedanalyseprogrammet spores vi individuelle filopodier. Sammenligning af filopodial læng…

Discussion

Her præsenterer vi en detaljeret protokol til sporing af filopodial vækstdynamik og analyse af relative proteinkoncentrationer i disse dynamiske strukturer via den konvekse skrogalgoritme. Ved hjælp af softwaren kan op til 3 kanaler sammenlignes parvis i et enkelt løb, hvorved de relative koncentrationer af to kanaler ( dvs. proteiner) bestemmes gennem hele forlængelses- / tilbagekredscyklusen og opbevares som billed- og datafiler i separate mapper. Udover de rutinemæssige operationer indeholder softwaren…

Materials

DMEM	Life Technologies	31966-021
10% Fetal bovine serum	Biochrom AG	L11-044
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-027
1% penicillin/streptomycin	Biochrom AG	12212
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103-049
B27	Life Technologies	17504-044
HEPES (1M stock solution)	Life Technologies	15630
Citrine-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
Hela	Leibniz Institute DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Institute DSMZ	ACC-60
3T3 cells	Leibniz Institute DSMZ	ACC-59
Microscope	Nicon Eclipse
Camera	Andor	DU888 Ultra
Confocal Unit	Yokagawa	CSU-X1
Pyruvate	Gibco	31966-021