動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース
Summary
我々は、動的細胞突起の長さに沿った相対的なタンパク質濃度の半自動追跡のためのソフトウェアソリューションを提示する。
Abstract
フィロポディアは、移動および細胞 – 細胞通信に関連する動的で指様の細胞突起である。糸球体の開始、伸長、その後の安定化または収縮の基礎となる複雑なシグナル伝達機構をよりよく理解するためには、これらの動的構造における時空間タンパク質活性を決定することが重要である。フィロポディアのタンパク質機能を解析するために、我々は最近、フィロポードの形状変化に適応する半自動追跡アルゴリズムを開発した。ここでは、最適化された細胞操作、画像取得およびソフトウェア分析のための詳細な段階的プロトコールを提示する。また、画像解析やデータ表示の際にオプション機能を使用するための手順や、重要なステップすべてに関するトラブルシューティングのガイドラインを提供します。最後に、dの比較フィロポディア定量化のために利用可能な他のプログラムと共に、エスケープされた画像分析ソフトウェア。一緒に、提示されたプロトコルは、画像分析ソフトウェアを用いて糸状突起におけるタンパク質動態の正確な分析のためのフレームワークを提供する。
Introduction
アクチン調節タンパク質の時空間制御は、フィロポジウムダイナミクス1,2に関連している。したがって、これらの動的構造の開始、伸長、安定化または崩壊の根底にある機構の理解を促進するためには、時間の経過とともに糸状体の長さに沿って空間的に分解されたタンパク質濃度を追跡することが重要である 3,4 。線維柱は、絶えず5つ折りになって屈曲する動的な微細構造であり、したがって、ラインスキャンのような単純なアプローチを用いた分析が不可能である細胞質ゾルにおけるタンパク質分析とは異なり、
人工肛門形状を追跡するためのさまざまなソフトウェアソリューションが利用可能です（6,7,8,9）。類似細胞体内のタンパク質動態をレシオメトリックに追跡するソフトウェアが開発されました10,11 。我々は、有形形状の自動追跡と時空間タンパク質解析を組み合わせるために、最近、凸包アルゴリズム12に基づく画像解析ソフトウェアを開発した。この新しい分析方法は、グラフィカルユーザーインターフェース（GUI） を介して操作され、初めて、繊維口径および成長速度に沿った相対的なタンパク質濃度を組み合わせることにより、これらの動きに関係なく時空間タンパク質分布の正確な測定を可能にする動的構造12 。
ソフトウェアの背後にある考え方（ソースコードは自由に利用可能です、以下を参照）は、凸包の頂点の1つがフィリピンの先端と一致することです（ 図1A ）。次のフレームfoを見ることによってrは凸包の最も近い頂点であり、ムービングチップは映画全体を通して追跡することができる。先端が各フレームで検出されると、フィリピンの基底の基準点（ 図1B ）と先端を結合することによって、その位置を軸の描画に使用します。最後に、軸に直交する線に沿った最大強度を有する中央値画素によって位置が決定される等距離節点を使用して、骨棘形状に従う骨格を決定する。この適応性のあるバックボーンを利用して、キモグラフを作成して、糸状体の長さに沿って最大3チャンネルの糸球体の成長およびタンパク質濃度を追跡する（ 図1C ）。
図1：イメージ解析ソフトウェアの動作原理 （ A ）後ろのアルゴリズムソフトウェア。ステップ1では、ユーザは、フィロポジウムの基準（ベース）および頂点（先端）を指定する。ステップ2-1では、最大輝度値を有する中央値ピクセルを用いてフィリピンのバックボーンが得られる。ステップ3では、バックボーンを空間タンパク質強度プロファイルに使用する。ステップ2-2では、ソフトウェアは次のフレームの先端を自動的に追跡する。全体の手順が繰り返されます。 （ B ）追跡に使用されている凸包のような重要な要素を導入している実在極を持つアルゴリズムのスナップショット。 （ C ）アルゴリズムで測定可能なパラメータの概要。この数字は参考文献12から変更されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
画像解析ソフトウェアは、グラフィカルな使用によってMatlab（プログラミングソフトウェアと呼ばれる）で操作されますrインターフェース。特定の実験設定の柔軟性と堅牢性を最大限にするために、ユーザーは一連のトラッキングパラメータ（許容される曲げ角度やフレーム間移動など）を調整したり、ムービーの一部の修正（クロッピング、回転、 （ 図2Aおよび表1） 。
| GUI | いいえ。 | 必須 | 説明 | 名前（GUI内） | ||||
| ＃1 | 1a | Y | （ボックスをチェックインして）セル本体を表す積み上げられた.tiffファイルをロードするか、チャンネルからスーパーインポーズされたセル本体を作成する | CellBody | ||||
| ＃1 | 1b | Y | <td colspan="5">タンパク質1に対応する積み上げ画像ファイルを読み込むタンパク質1 | |||||
| ＃1 | 1c | Y | タンパク質2に対応する積み重ね画像ファイルを読み込む | プロテイン2 | ||||
| ＃1 | 1d | Y | タンパク質3に対応する積み重ねられた画像ファイルを読み込む | プロテイン3 | ||||
| ＃1 | 1e | N | プリロードされた積み重ねられた画像ファイルにすべてをリセットします。 | リセット | ||||
| ＃1 | 2a | Y | スクロールバーを使用して、GUIウィンドウ＃2での分析の初期フレームを決定します。 | NA | ||||
| ＃1 | 2b | Y | スクロールバーを使用して、GUIウィンドウ＃2で解析するための最終フレームを決定します | NA | ||||
| ＃1 | 2c | Y | curreを表すスクロールバーNTフレーム | NA | ||||
| ＃1 | 2d | N | すべてのピクセルがゼロに設定されるピクセルのグレー値 | NA | ||||
| ＃1 | 2e | N | すべてのピクセルが最大値に設定されるピクセルのグレー値 | NA | ||||
| ＃1 | 2f | N | <2e>＆<2f>で指定されたピクセルの輝度値を設定します。 | セット | ||||
| ＃1 | 2g | N | 強度調整されたムービーを再生する | 遊びます | ||||
| ＃1 | 2時間 | N | クロップ画像 | 作物 | ||||
| ＃1 | 2i | N | イメージを回転する | 回転する | ||||
| ＃1 | 2j | N | スタック全体の領域を削除する | リージョンを削除する | ||||
| ＃1 | 3a | Y | クリックすると「解析ウィンドウ」（GUIウィンドウ＃2）が開きます。 | 追跡ウィンドウ | ||||
| ＃1 | 3b | Y | ピクセルのサイズをミクロン単位で入力します | ピクセルサイズを入力してください | ||||
| ＃2 | 4 | Y | クリックすると、重ね合わされたセル本体の境界/エッジ画像が生成されます | 境界 | ||||
| ＃2 | 5 | Y | クリックして、糸状虫の基部と先端を選択します | Referernce | ||||
| ＃2 | 6a | Y | セグメントまたはノードの数を入力してください | セグメント数 | ||||
| ＃2 | 6b | Y | スキャンの長さを入力します（軸に垂直） | スキャン幅 | ||||
| ＃2 | 6c | Y | フィロポディアが曲がり始める長さを入力してください | 後の正確な測定 | ||||
| ＃2 | 6d | Y | 先端検出円の半径（すなわち、次のフレームで頂点が局在化できる領域）を入力します。 | 先端検出の半径 | ||||
| ＃2 | 6e | Y | フィリピンが垂直軸から曲げることができる最大角度を入力します | 角度の閾値 | ||||
| ＃2 | 6f | N | その特定のフレームのベースとチップの参照点を追加する | リファレンスを選択 | ||||
| ＃2 | 6g | N | 特定のフレームの曲がり始める長さを入力します | 後の正確な測定 | ||||
| ＃2 | <td> 6hN | 特定のフレームの検出円の半径を入力します | 先端検出の半径 | |||||
| ＃2 | 6i | N | 特定のフレームのすべてのパラメータを入力した後、その値をメモリおよびファイルに保存して参照する | 追加 | ||||
| ＃2 | 6j | N | クリックすると、そのフレームの手動パラメータが削除されます。 | 削除 | ||||
| ＃2 | 6k | N | クリックすると、すべてのフレームで 'オプション機能パネル'を使用して手動で保存されたすべてのパラメータが削除されます | リセット | ||||
| ＃2 | 6l | N | 追跡する前にチェックインして、すべての追跡結果を将来の参照のためにメモリに格納する | 履歴トレース | ||||
| ＃2 | 7 | Y | トラッキングを開始するにはクリックしてください | トラックと分析 | ||||
| ＃2 | 8a | N | クリックしてタンパク質チャネル強度の追跡を開始する | タンパク質の強度を分析する | ||||
| ＃2 | 8b | N | チェックインして、糸状体の長さに沿ったタンパク質チャネルの強度を追跡する | 完全な糸状仮足 | ||||
| ＃2 | 8c | N | リファレンスタンパク質またはプロテインAを追跡するためにチェックイン | プロテインA | ||||
| ＃2 | 8d | N | タンパク質Bを追跡するためにチェックイン | ProteinB | ||||
| ＃2 | 8e | N | タンパク質Cを追跡するためにチェックイン | ProteinC | ||||
| ＃2 | 8f | N | タンパク質の平均強度を追跡するためにチェックインする電子チップ | リーディングチップ | ||||
| ＃2 | 8g | N | 先端の長さを入力してください | 先端の長さ | ||||
| ＃2 | 8時間 | N | チップが形成を開始するベースからの最小距離を入力します | 閾値 | ||||
| ＃2 | 8i | N | 先頭のチップ解析結果をファイルに保存する場合にクリックします | ボタンを押す | ||||
| ＃2 | 9a | N | レシオメトリックなタンパク質分析を開始するにはクリックしてください | 比較 | ||||
| ＃2 | 9b | N | タンパク質BをAと比較するためにチェックインする | log10（B / A） | ||||
| ＃2 | 9c | N | チェックインして、プロテインCとAを比較する | log10（C / A） | ||||
| ＃2 | <td> 9dN | 先端のAに関してプロテインBを比較するためにチェックインする | log10（B / A） | |||||
| ＃2 | 9e | N | 先端のAに関してプロテインCを比較するためにチェックインする | log10（C / A） | ||||
| ＃2 | 10a | N | 他のカラーマップを選択してください（デフォルト：Jetplot） | カラーマップ | ||||
| ＃2 | 10b | N | カラーマップを編集する | カラーマップを編集 | ||||
表1：GUIに存在するすべての機能の概要Windows＃1および＃2。
これが完了すると、プログラムは凸包を作成し、ムービー全体で自動的にヒントを追跡します。レシオメトリックなキモグラフ、成長速度、およびフィリピンの長さなど、映画から抽出されたパラメータa表示され、画像として、またデータファイルとして作業フォルダに保存されます。その後、生存期間、成長速度および収縮速度などの他のパラメータを抽出し、格納されたデータファイルからさらに分析することができる（ 図2B ）。
図2：イメージ解析ソフトウェアを使用するためのグラフィカルユーザーインターフェイス （ A ）GUIウィンドウ＃1は画像の読み込みと処理に使用されます。プログラムは最大3つのタンパク質チャネルをロードすることができ、それによって2つのチャネルが対に比較される。 （ B ）GUIウィンドウ＃2は、フィロポジウムと時空間および比率メトリックタンパク質分析を追跡するために使用されます。ここでも、オプション機能は緑色でマークされています。この数字は変更されています参考文献12から編集されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
ここでは、サンプルの準備とソフトウェア処理のための詳細なプロトコールを示します。細胞の培養と画像分析に最適化されたムービーの取得に関する詳細な手順から始めます。このデータ取得セクションに続いて、画像分析ソフトウェアを操作するための詳細な説明が続きます。プロトコル全体を通して、データの収集と処理の際に考慮する必要がある重要なステップとオプション機能を紹介します。最後に、我々は画像解析ソフトウエアを用いて様々なモデルシステムからの糸状仮説を解析し、記述された画像解析ソフトウェアと、有棘線量定量化のための他のプログラムとの比較および制限および将来の方向性に関する議論を終了する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、凸包アルゴリズムを用いて、これらの動的構造における糸球体成長ダイナミクスおよび相対タンパク質濃度の分析のための詳細なプロトコルを提示する。このソフトウェアを使用すると、1回の操作で最大3つのチャネルをペアワイズで比較することができます。これにより、2つのチャネル（タンパク質）の相対濃度が伸長/収縮サイクルを通じて決定され、画像ファイルとデータフ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、DFG（EXC-1003からMG）への資金提供を認めている。
Materials
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovine serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stock solution) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cells | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscope | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
Referências
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