동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스
Summary
우리는 동적 세포 돌출부의 길이에 따른 상대 단백질 농도의 반자동 추적을위한 소프트웨어 솔루션을 제시합니다.
Abstract
Filopodia는 이동 및 세포 – 세포 통신과 관련된 동적 인 손가락 모양의 세포 돌출부입니다. 섬유 유두의 개시, 연신율 및 후속 안정화 또는 수축의 근본적인 복잡한 신호 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 이러한 동적 구조에서 시공간 단백질 활성을 결정하는 것이 중요합니다. Filopodia에서 단백질 기능을 분석하기 위해 우리는 최근에 filopodial 모양 변화에 적응하는 반자동 추적 알고리즘을 개발하여 전체 filopodial 길이에 따른 돌출부 역학 및 상대 단백질 농도의 병렬 분석을 허용했습니다. 여기서는 최적화 된 셀 처리, 이미지 수집 및 소프트웨어 분석을위한 자세한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 또한 이미지 분석 및 데이터 표현 과정에서 옵션 기능을 사용하는 방법에 대한 지침과 함께 중요한 모든 단계에 대한 문제 해결 지침을 제공합니다. 마지막으로, 우리는 또한 dfilopodia 부량을 위해 유효한 다른 프로그램을 가진 escribed 영상 분석 소프트웨어. 함께 제시된 프로토콜은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 유두 돌출에서 단백질 역학의 정확한 분석을위한 프레임 워크를 제공합니다.
Introduction
actin 조절 단백질의 시공간 조절은 filopodium dynamics 1 , 2 와 관련이있다. 시간에 따른 전체의 유두 길이에 따른 공간적으로 분석 된 단백질 농도를 추적하는 것은 이러한 동적 구조의 개시, 신장, 안정화 또는 붕괴의 기초가되는 메커니즘에 대한 우리의 이해를 증진 시키는데 중요하다 3 , 4 . 세포 모양의 변화가 더 큰 규모에서 일어나는 세포질에서의 단백질 분석과는 달리, filopodia는 끊임없이 5 번 굴곡하여 선형 주사와 같은 간단한 접근법을 사용하여 분석을 방해하는 동적 인 미세 구조이다.
유두 모양 추적을위한 다양한 소프트웨어 솔루션을 사용할 수 있습니다 6 , 7 , 8 , 9 . 유사성ise, 세포 동체 내에서 단백질 동역학의 비율 측정 용 소프트웨어가 개발되었습니다 10 , 11 . 우리는 철근 형상의 자동 추적과 시공간 단백질 분석을 결합하기 위해 최근에 convex-hull 알고리즘을 기반으로 한 이미지 분석 소프트웨어를 개발했습니다. 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 를 통해 작동하는이 새로운 분석 방법은 처음으로 유두 길이와 성장 속도에 따른 상대적 단백질 농도를 결합하여 이들의 움직임에 관계없이 시공간 단백질 분포의 정확한 측정을 가능하게합니다 동적 구조 12 .
소프트웨어의 아이디어 (소스 코드는 자유롭게 사용할 수 있습니다. 아래 참조)는 볼록 선체의 꼭지점 중 하나가 필리 포듐의 팁과 일치한다는 것입니다 ( 그림 1A ). 후속 프레임을 보면r은 convex-hull의 가장 가까운 꼭지점이며 움직이는 팁은 전체 영화에서 추적 할 수 있습니다. 일단 각 프레임에서 팁이 검출되면, 그 위치는 필로소움의 기저에있는 기준점과 팁을 결합함으로써 축을 그리는 데 사용됩니다 ( 그림 1B ). 마지막으로, 축에 직각 인 선을 따라 최대 강도를 갖는 중앙 픽셀에 의해 위치가 결정되는 등거리 노드 점을 사용하여 파일 포트 모양을 따르는 백본을 결정합니다. 이 adaptive backbone을 이용하여 kymograph가 생성되어 filopodial 길이 ( 그림 1C )를 따라 최대 3 개의 채널에 대한 filopodial 성장과 단백질 농도를 추적합니다.
그림 1 : 이미지 분석 소프트웨어의 작동 원리. ( A ) 뒤에있는 알고리즘소프트웨어 1 단계에서 사용자는 필로폰의 참조 (기본)와 꼭지점 (끝)을 지정합니다. 단계 2-1에서, 최대 강도 값을 갖는 중간 값 픽셀을 사용하여 필로폰의 백본을 얻는다. 3 단계에서 백본은 공간 단백질 강도 프로파일에 사용됩니다. 단계 2-2에서 소프트웨어는 자동으로 후속 프레임의 팁을 추적합니다. 전체 절차가 반복됩니다. ( B ) 추적에 사용되는 볼록 선체와 같은 중요한 요소를 소개하는 실제 사상 최고로 알고리즘의 스냅 샷. ( C ) 알고리즘으로 측정 할 수있는 매개 변수 개요. 이 숫자는 참고 문헌 12 에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이미지 분석 소프트웨어는 그래픽 사용을 통해 Matlab (프로그래밍 소프트웨어라고 함)에서 작동합니다.r 인터페이스. 특정 실험 설정에 대한 유연성과 견고성을 극대화하기 위해 사용자는 일련의 추적 매개 변수 ( 예 : 허용 된 굽힘 각도 및 프레임 간 이동)를 조정할 수 있으며 영화 ( 예 : 자르기, 회전, 원하지 않는 객체 제거) ( 도 2a 및 표 1) .
| GUI | 아니. | 필수 | 기술 | 이름 (GUI에서) | ||||
| #1 | 1a | 와이 | 셀 본문을 나타내는 스택 된 .tiff 파일로드 (상자를 체크 인) 또는 채널에서 중첩 된 셀 본문 만들기 | CellBody | ||||
| #1 | 1b | 와이 | <td colspan="5"> 단백질 1에 해당하는 적층 이미지 파일로드단백질 1 | |||||
| #1 | 1c | 와이 | 단백질 2에 상응하는 스택 이미지 파일로드 | 단백질 2 | ||||
| #1 | 1d | 와이 | 단백질 3에 해당하는 적층 이미지 파일로드 | 단백질 3 | ||||
| #1 | 1e | 엔 | 미리로드 된 이미지 파일에 대한 모든 것을 재설정합니다. | 다시 놓기 | ||||
| #1 | 2a | 와이 | GUI 창 # 2에서 분석을위한 초기 프레임을 결정하기 위해 스크롤 막대 | 없음 | ||||
| #1 | 2b | 와이 | GUI 창 # 2에서 분석 할 최종 프레임을 결정하기 위해 스크롤 막대 | 없음 | ||||
| #1 | 2c | 와이 | curre를 나타내는 스크롤 막대NT 프레임 | 없음 | ||||
| #1 | 2d | 엔 | 모든 픽셀이 0으로 설정되는 픽셀의 회색 값 | 없음 | ||||
| #1 | 2e | 엔 | 모든 픽셀이 최대 값으로 설정되는 위의 픽셀의 회색 값 | 없음 | ||||
| #1 | 2f | 엔 | <2e> 및 <2f>에 지정된 픽셀의 강도 값을 설정합니다. | 세트 | ||||
| #1 | 2g | 엔 | 강도 조절 동영상 재생 | 놀이 | ||||
| #1 | 2 시간 | 엔 | 자르기 이미지 | 수확고 | ||||
| #1 | 2i | 엔 | 이미지 회전 | 회전 | ||||
| #1 | 2j | 엔 | 전체 스택에서 영역 삭제 | 영역 삭제 | ||||
| #1 | 3a | 와이 | '분석 창'(GUI 창 # 2)을 열려면 클릭하십시오. | 추적 창 | ||||
| #1 | 3b | 와이 | 픽셀 크기를 미크론 단위로 입력하십시오. | 픽셀 크기 입력 | ||||
| # 2 | 4 | 와이 | 중첩 된 셀 본문의 경계 / 가장자리 이미지를 생성하려면 클릭하십시오. | 경계 | ||||
| # 2 | 5 | 와이 | 유두의 기저부를 클릭하여 선택하십시오. | Referernce | ||||
| # 2 | 6a | 와이 | 세그먼트 또는 노드 수를 입력하십시오. | 세그먼트 수 | ||||
| # 2 | 6b | 와이 | 스캔 길이 (축에 수직)를 입력하십시오. | 스캔 너비 | ||||
| # 2 | 6c | 와이 | 철학이 굴곡을 시작하는 길이를 입력하십시오. | 정확한 측정 후 | ||||
| # 2 | 6d | 와이 | 팁 감지 원의 반지름을 입력하십시오 (즉, 다음 프레임에서 정점이 지역화 될 수있는 영역) | 팁 감지 반경 | ||||
| # 2 | 6e | 와이 | filypodium이 수직 축에서 구부릴 수있는 최대 각도를 입력하십시오. | 각도 임계 값 | ||||
| # 2 | 6f | 엔 | 해당 특정 프레임에 대한 기준점 및 기준점을 추가합니다. | 참조 선택 | ||||
| # 2 | 6g | 엔 | 해당 특정 프레임에 대해 절곡이 시작되는 길이를 입력하십시오. | 정확한 측정 후 | ||||
| # 2 | <td> 6h엔 | 특정 프레임에 대한 감지 원의 반지름을 입력하십시오. | 팁 감지 반경 | |||||
| # 2 | 6i | 엔 | 특정 프레임에 대한 모든 매개 변수를 입력 한 후 추가 참조를 위해 값을 메모리 및 파일에 저장하려면 클릭하십시오. | 더하다 | ||||
| # 2 | 6j | 엔 | 해당 프레임의 수동 매개 변수를 삭제하려면 클릭하십시오. | 지우다 | ||||
| # 2 | 6k | 엔 | 모든 프레임에 대해 '선택적 기능 패널'을 사용하여 수동으로 저장된 모든 매개 변수를 삭제하려면 클릭하십시오. | 다시 놓기 | ||||
| # 2 | 6l | 엔 | 추적 전에 모든 추적 결과를 메모리에 저장하여 나중에 참조 할 수 있도록하십시오. | 기록 추적 | ||||
| # 2 | 7 | 와이 | 추적을 시작하려면 클릭하십시오. | 추적 및 분석 | ||||
| # 2 | 8a | 엔 | 단백질 채널 강도 추적 시작하려면 클릭하십시오. | 단백질 농도 분석 | ||||
| # 2 | 8b | 엔 | 유두 길이에 따른 단백질 채널 강도를 추적하려면 체크인하십시오. | 전체 filopodia | ||||
| # 2 | 8c | 엔 | 참조 단백질 또는 단백질 A를 추적하기 위해 체크인하십시오. | ProteinA | ||||
| # 2 | 8d | 엔 | 단백질 B를 추적하기 위해 체크인하십시오. | ProteinB | ||||
| # 2 | 8e | 엔 | 단백질 C를 추적하기 위해 체크인하십시오. | ProteinC | ||||
| # 2 | 8f | 엔 | 체크인시 평균 단백질 강도를 확인하십시오.전자 팁 | 이끄는 팁 | ||||
| # 2 | 8g | 엔 | 팁의 길이를 입력하십시오. | 팁 길이 | ||||
| # 2 | 8 시간 | 엔 | 팁이 형성되기 시작하는 바닥에서 최소 거리를 입력하십시오 | 문지방 | ||||
| # 2 | 8i | 엔 | 선도 팁 분석 결과를 파일로 저장하려면 클릭하십시오. | 누름 단추 | ||||
| # 2 | 9a | 엔 | Ratiometric 단백질 분석을 시작하려면 클릭하십시오 | 비교 | ||||
| # 2 | 9b | 엔 | 단백질 B를 A와 비교하기 위해 체크인하십시오. | log10 (B / A) | ||||
| # 2 | 9c | 엔 | A와 관련하여 단백질 C를 비교하기 위해 체크인하십시오. | log10 (C / A) | ||||
| # 2 | <td> 9d엔 | 팁에서 A와 관련하여 단백질 B를 비교하기 위해 체크인하십시오. | log10 (B / A) | |||||
| # 2 | 9e | 엔 | 팁에서 A와 관련하여 단백질 C를 비교하려면 체크인하십시오. | log10 (C / A) | ||||
| # 2 | 10a | 엔 | 다른 색상 맵을 선택하십시오 (기본값 : Jetplot). | 컬러 맵 | ||||
| # 2 | 10b | 엔 | 색상 맵 편집 | 색상 맵 편집 | ||||
표 1 : GUI에있는 모든 기능 개요 Windows # 1 및 # 2.
이 작업이 완료되면 프로그램은 볼록 선체를 만들고 영화 전체에 걸쳐 팁을 자동으로 추적합니다. Ratiometric kymograph, 성장 속도 및 유두 길이와 같은 영화에서 추출한 매개 변수다시 표시되며 이미지 및 데이터 파일로 작업 폴더에 저장됩니다. filopodial lifetime, growth rate 및 retraction rate와 같은 다른 매개 변수를 추출하고 저장된 데이터 파일 ( 그림 2B )에서 추가로 분석 할 수 있습니다.
그림 2 : 이미지 분석 소프트웨어를 사용하기위한 그래픽 사용자 인터페이스. ( A ) GUI 창 # 1은 이미지로드 및 처리에 사용됩니다. 이 프로그램은 최대 3 개의 단백질 채널을로드 할 수 있으므로 2 개 채널을 쌍으로 비교합니다. 이 창에는 추적 전에 이미지를 사전 처리하기위한 필수 (파란색) 및 선택적 기능 (녹색)이 있습니다. ( B ) GUI 창 # 2는 시신경 및 비율 메트릭 단백질 분석뿐만 아니라 필로도를 추적하는 데 사용됩니다. 다시 옵션 기능은 녹색으로 표시됩니다. 이 숫자는 수정되었습니다.참고 문헌 12 에서 편집. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기에서는 샘플 준비 및 소프트웨어 처리를위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 세포 배양과 이미지 분석에 최적화 된 영화 획득에 대한 자세한 지침부터 시작합니다. 데이터 수집에 대한이 절 다음에는 이미지 분석 소프트웨어 작동에 대한 자세한 설명이 나와 있습니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 데이터를 수집하고 처리 할 때 고려해야 할 중요한 단계와 옵션 기능을 소개합니다. 마지막으로 우리는 이미지 분석 소프트웨어로 다른 모델 시스템의 파일 포리아를 분석 한 후 설명 된 이미지 분석 소프트웨어와 유치원 계량화에 사용할 수있는 다른 프로그램을 비교하고 제한 사항 및 향후 방향에 대한 논의를 마무리합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 우리는 철근 – 성장 알고리즘을 통해 이러한 동적 구조에서의 상대 단백질 농도 분석과 생식기 성장 역학을 추적하기위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 소프트웨어를 사용하면 최대 3 개의 채널을 한 번에 쌍으로 비교할 수 있으므로 두 채널 ( 즉, 단백질)의 상대적 농도가 확장 / 수축 사이클 전체에서 결정되고 이미지 파일과 데이터 파일로 별도의 폴더에 저장됩니다. 일상적?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 DFG (EXC-1003에서 MG까지)의 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovine serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stock solution) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cells | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscope | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
Referências
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